鍼治療による麻酔下ラットにおける肝臓および腎臓の酸化ストレスの軽減

13 – (株)日立製作所ORIGINAL ARTICLE
メタボリズム

電気鍼治療は麻酔ラットの肝臓と腎臓の酸化ストレスを減衰させる1

電気鍼治療は麻酔ラットの肝臓と腎臓の酸化ストレスを軽減する

Agamenon Honório SilvaI; Lanese Medeiros FigueiredoI; Paulo Araujo DiasI; Alberico Ximenes do Prado NetoII; Paulo Roberto Leitão de VasconcelosIII; Sérgio Botelho GuimarãesIV

Iフェロー修士、外科部門、大学院プログラム、UFC、Ceara, Brazil. 技術的手順、データの取得と解釈。 本論文は修士論文の一部である（AHS）
IGraduate student, UFC, Ceara, Brazil.
IIIPhD、准教授、コーディネーター、大学院プログラム、外科、UFC、セアラ、ブラジル。 データの修正と解釈
IVPhD、准教授、外科部門、ヘッド、LABCEX、UFC、セアラ州、ブラジル。

Correspondence

ABSTRACT

目的：麻酔下のラットの肝臓と腎臓における酸化ストレスを調節するために、ツボであるZusanli (ST-36) とZhongwan (CV-12) を組み合わせた1回の電気鍼治療（EA）セッションの効果について調査すること。
方法: 健康なラット18匹を無作為に3群に分け(n=6)、ketamine (90mg kg-1 body weight) + xylazine (10mg/kg body weight) で腹腔内麻酔をかけた。 G-1：コントロール（麻酔）、G-2：麻酔＋EA10Hz、10mA、10Hz）を右ST-36とCV-12のツボに30分間印加した。 G-3は10倍高い周波数（100Hz）を用いて同様に処理した。 G6PDH活性、マロンジアルデヒド（MDA）、グルタチオン（GSH）濃度を分光光度計で測定したところ、G6PDH活性は1.5倍、マロンジアルデヒド（MDA）濃度は1.5倍であった。
結果：EA10Hz（p<0.01）およびEA100Hz（p<0.001）を受けたラットでは、対照G-1と比較して肝MDAおよびGSH濃度が有意に増加した。 肝臓および腎臓のG6GPH活性は、EA100HzのラットのG-1に比べ、G-2（p<0.01）およびG-3（p<0.001）において有意に減少した。 EA10Hzラットの腎臓G6PDH活性にも同様のパターンが見られた。
結論: 30分のEA10/100Hz単発セッションは、ラットモデルにおいて肝臓と腎臓組織の過酸化脂質を高め、同時に酸化ストレスを軽減した。

キーワード 鍼治療. 電気鍼。 脂質過酸化。 酸化ストレス。

RESUMO

目的: 麻酔をかけたラットの肝臓と腎臓の酸化ストレスの制御における、Zusanli (E-36) と Zhongwan (RM-12) を同時に適用した一回の電気鍼治療の効果を調査すること。
方法：健康なラット18匹を無作為に3群（n = 6）に分け、ケタミン（90mg/kg体重）+キシラジン（10mg/kg体重）で麻酔をかけた。 G-1：コントロール（麻酔）、G-2：麻酔＋EA10Hz、G-3：麻酔＋EA100Hz。 G-2群のラットには，右ST-36とVC-12のツボにEA（パルス矩形波，10 mA，10 Hz）を30分間印加した． G-3グループのラットでは、10倍の周波数（100Hz）が使用された。 G6PDH酵素の活性、マロンジアルデヒド（MDA）とグルタチオン（GSH）の濃度は、分光光度計で確認した。
結果：10Hz（p<0.01）および100Hz（p<0.001）を用いたAEを受けたラットでは、コントロールと比較して、MDAおよびGSHの肝臓濃度が有意に増加した。 100Hzを投与したラットの肝臓と腎臓のG6GPH活性は、G-1群に比べG-2群（p＜3066＞0.01）、G-3群（p＜3066＞0.001）で有意に低下していた。
結論：10/100HzのEAを1回30分行うと、健康なラットの肝臓と腎臓で過酸化脂質が増加し、同時に酸化ストレスが減少する。

説明文。 鍼灸のことです。 電気鍼。 脂質の過酸化。 酸化ストレス ラット

はじめに

手刺鍼（MA）は、中国伝統医学の主要な治療法の一つである。 これは、鋭く細い針を、身体の特定のポイント（ツボ）に刺すというものです。 MAは東洋の国々で数千年にわたり使用されており、西洋でも医師や患者さんに受け入れられつつあります1。 電気鍼（EA）はこの技術を改良したもので、あらかじめ体内に挿入した鍼に小さな電流を流すもので、多くの特定の臨床および研究の場でより一貫した再現性のある結果が得られると考えられています2-4。 Zusanli（ST-36）ツボにEAを適用すると、ラット脊髄5、脳6、血清7、豚心筋8などの虚血/再灌流実験モデルにおいて過酸化脂質が減少しました。 は、ラットの肝機能に対する単回、急性（7パルス/秒、0.75ボルト）および慢性（4パルス/秒、0.75ボルト）鍼治療を21日間、交互に行った効果を調査しました。 背中の2つのツボとST-36を使用した。 慢性治療後、肝ミクロソーム過酸化脂質値は有意に減少した。 さらに、ST-36のツボを手で刺激すると敗血症による腎障害を抑制できることから10、そのツボを電気刺激すると腎組織における細胞膜障害の指標であるMDAの濃度が変化する可能性が考えられる。 NADPHは細胞内の主要な還元剤であり、その生成は主にグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼに依存している。 G6PDHの活性が阻害されると、酸化的損傷からの保護に不可欠な補酵素であるNADPHの活性が同時に減少する。 細胞の完全性と抗酸化システム全体は、NADPH11の十分な供給に依存している。 多くの論文で、ST-36ツボのMAとEAが、さまざまな実験的疾患における酸化ストレスの抑制に効果があることが実証されています5-9。 さらに、実験研究でよく使用される麻酔薬であるケタミン＋キシラジンの使用は、健康な動物にある程度の酸化ストレスを誘発することがある12-13。

2Hzで鍼を使用してCV-12ツボを刺激すると、副腎から大量の内因性オピオイドペプチドが分泌されることが以前に示されている14。 また、高周波EA（15Hz）を用いてツボCV-12を刺激したところ、内因性オピオイドペプチドの分泌源が複数発見された15。 そこで、10Hzと100Hzの2種類の周波数でST36とCV-12の両ツボを刺激するEAを適用して、肝臓と腎臓のMDAとGSH含量を修正できるか、10Hzと100HzのEAで脂質過酸化と酸化ストレスに違いがあるかどうかを健康なネズミで調べることを目指した。

方法

動物の準備

医学部小動物飼育施設（セアラ連邦大学）から提供された体重280～400gのWistar雄ラットは、制御環境条件（24℃ _相対湿度40%～60%、12時間交代制明暗サイクル、餌と水自由摂取）下で飼育されていた。 ヒトの右脚のST-36とCV-12に相当するツボを選び、鍼と電気刺激で刺激した。 ツボの命名法はWHOの命名法16に従った。 ST-36は、膝関節の腓骨頭の5mm下、脛骨前結節の2mm外側に位置するツボである。 ST-36のツボを刺すと、外側腓骨皮神経、伏在神経皮枝、深部腓骨神経が刺激されます17-18。 CV-12は、上腹部の前正中線、胸骨結合部の下20mmに位置するツボです。 この部位は第8肋間神経前部皮膚枝に支配されている18。 EL-608電気刺激装置は、NKL Produtos Eletrônicos Ltda., Brusque, Santa Catarina, Brazilから購入した。

実験群

動物には、ケタミン（90mg/体重）およびキサラジン（10mg/体重）の新鮮調製混合物で腹腔内麻酔を施した。 ラットは以下のように3つの等しいグループにランダムに割り当てられた：

* グループ1（麻酔）- 6ラット

* グループ2（EA 10Hz）- 6ラット

* グループ3（EA 100Hz）- 6ラット

グループ1（コントロール）ラットは記述したように麻酔をかけられた。 60分後、ラットの腹部を開き、肝臓と右腎臓を摘出した。 グループ2（EA10Hz）ラットは、記載されたように麻酔された。 75%エタノールで消毒した使い捨てステンレス針（0.25mm×30mm）を右ST-36とCV-12のツボに2-3mmの深さで垂直に刺入した。 電極を両針と電気刺激装置（NKL EL-608）に接続し，パルス矩形波，10 Hz，10 mAを30分印加した． 30分後に試料を採取した。 グループ3（EA100Hz）ラットはグループ2と同様にEAを行ったが、10倍の周波数（100Hz）を用いた。

生化学的測定

測定したパラメータは、G6PDH活性、マロンジアルデヒド（MDA）およびグルタチオン（GSH）濃度であった。 組織サンプルは液体窒素で凍結し、肝臓と腎臓のホモジネートを調製して分析するまでガラス管に-70℃で保存した。 脂質過酸化は、TBA反応性物質19としてマロンジアルデヒドを測定することによってアッセイした。 10%ホモジネートに H3PO4 (1%, 3 mL) と TBA 水溶液 (0.6%, 3 mL) を加え、0.5 mL とした。 アッセイ培地を振盪し、沸騰水バス上で45分間加熱した。 冷却後、4 mLのn-ブタノールを加え、混合物を振とうした。 n-ブタノール層を1200gで15分間遠心分離した後、分光光度計（Beckman DU 640 B; Beckman Instruments, now Beckman Coulter, Inc, Fullerton, CA, USA）で、吸収波長を535nmと520nmとしてその光学濃度を測定した。 2回の光学密度の測定結果の差をTBA値とし、精巣中のマロンジアルデヒド（MDA）量を算出し、MDA標準と比較し、湿潤組織1gあたりのMDAのマイクロモル数で表示した。 GSH量は、チオール基と5-5-ジチオビス-（2-ニトロ安息香酸）の反応により、412nmで光を吸収する化合物を生成するSedlak and Lindsay20の方法によって推定された。 GSHの量は、様々な濃度のGSHを用いて同じ条件下で同時に得られた標準曲線から決定した。 G6PDH活性は、先に述べた方法で推定した21。 酵素活性は分光光度法で読み取った。

データ解析

計算と統計解析にはGraphpad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com)を使用した。 すべての結果は、平均±SDで表した。 すべてのデータは、分布の検定を行った（Dallal-Wilkinson-Lilliefor P値によるKolmorogov-Smirnov検定）。 肝臓および腎臓組織におけるMDAおよびGSH濃度ならびにG6PDH活性における群間の差異を決定するために、必要に応じて一元配置分散分析またはクラスカル-ウォリス検定を行った。 ポストホック分析（TukeyまたはDunn）において、p<0.05の確率値は統計的有意性を示すとみなされた。

結果

GSH Assay

EA10HzおよびEA100Hzに供したラットは対照と比較して肝臓GSH濃度が著しく増加した（p<0.001）(図1)。 腎臓のGSH濃度は、EA10HzとEA100Hzの両群で同様の増加が見られた（図2）。 さらに、肝臓および腎臓のGSH濃度は、EA10Hz群と比較してEA100Hz投与ラットで有意に増加した。

MDA Assay

肝臓MDA濃度は、EA10Hz（p<0.01）およびEA100Hz（p<0.001）に供したラットでは、コントロール群に比べて顕著に増加した（図3）。 腎臓のMDA濃度は、EA10HzとEA100Hzの両群で同様に増加した（図4）。 腎臓MDA濃度はEA10Hz群と比較してEA100Hz群で有意に増加した。

G6PDH Assay

肝臓G6GPH活性はEA100Hz群でコントロール群と比較して有意に減少（p<0.001）した(図5)。 EA10Hzラットの腎臓G6GPH活性にも同様のパターンが見られた。 腎臓のG6PDH活性は両群で差がなかった（図6）。

考察

我々の実験において酸化ストレスは、動物実験または獣医処置中によく使用される解離性麻酔薬であるケタミンを使用して誘発された。 Alvaら12は、ケタミンが形質一酸化窒素レベルを増加させ、代謝性アシドーシスを誘発し、肝毒性には至らないものの、酸化的障害を引き起こすことを示した

低周波EAの抗酸化作用が実証されている。 Siuら6 は、頸部後面、後頭骨下、胸鎖乳突筋と僧帽筋の間の陥凹部にあるツボGB-20とST-36を脳虚血前に複数回電気刺激し、2Hz EAが脳虚血の脂質過酸化を一部調節すると結論づけた。 GB-20とST-36は同程度の有益な効果を示した6． 本研究では，EAを使用することにより，EA10Hz群およびEA100Hz群において，肝臓（図3）および腎臓（図4）のMDA濃度が有意に上昇した． また、EA100Hz群では、EA10Hz群と比較して、過酸化脂質のさらなる増加が見られた。 このことから、腎臓は肝臓よりも過酸化脂質の影響を受けやすいことが示唆された。 このモデルラットでは、高周波を用いた電気刺激を1回で行うと、脂質の過酸化が促進されるようである。 その結果、鍼刺激によりGSH値の低下とMDA値の上昇を抑制することがわかった。22は、1日2回、14日間行った古典的な鍼治療の効果を評価した。我々は、1回のセッションで電気刺激を使用することが、MDAレベルの上昇に関与していると考えている。 一方、1回で使用したEAは、肝臓（図1）および腎臓（図2）の両組織でGSH濃度の有意な上昇を誘導した。 EAの保護効果は、EA10Hzの動物に比べ、EA100Hzのラットの腎臓におけるGSH濃度の増加によって示されるように、周波数が高いほど大きい。

G6PDHは、酸化ストレスに対する細胞の反応に非常に重要な役割を担っている。 最近まで、この酵素の重要性は、他のNADPH生成経路を持たないヒト赤血球に限られるという考えが一般的であった23。 しかし、近年、G6PDHは、NADPHの代替生産経路を持つ真核細胞において、活性酸素から身を守る役割を担っていることが明らかになった24。 本研究では、EA10Hz と EA100Hz 群の肝臓で G6PDH 活性が有意に減少した。 EA10Hzラットの腎臓でも同様の活性低下がみられた。 EA100Hz ラットでは、腎臓の GSH 濃度が上昇し、同時に G6PDH の減少も認められました。

Yuら25 は、Taxus chinensis の細胞懸濁培養を用いて、G6PDH 活性と細胞内 GSH レベルが逆相関することを実証しています。 動物細胞でも同様の挙動を示す可能性がある。

他との比較における本研究の長所と短所については、本研究と直接比較できるような発表がない。 EAの過酸化作用がここで示されたにもかかわらず、他の研究6と対照的に、10Hzの電気刺激は他の研究者によって使用されていない。 発表された研究では、低周波のEA（2Hz）を複数回に分けて使用している。 本研究では、1回のセッションが利用された。 一方、100Hzと10Hzで処理したラットの肝臓と腎臓におけるG6PDH活性の低下と、それに伴うGSHレベルの上昇は、1回のEAセッション後、より高い周波数が酸化ストレスに対するより良い保護を誘導することを示唆した。 このメカニズムは、今のところ明らかではありません。 さらなる研究が、鍼治療の保護効果に新しい光を当てるかもしれない。

結論

収集したデータは、30分の単一のEA 10/100Hzセッションが、過酸化脂質を高め、同時にラットモデルで肝臓と腎臓組織のGSHレベルを増加させることによって酸化ストレスを軽減するという仮説を支持している

1. Campbell A. The origins of acupuncture. Acupunct Med. 2002;20(2-3):141

6. シウFK、ローSC、レオンMC. 成体ラットにおける脳虚血による脂質過酸化の抑制に対する複数回の虚血前電解鍼治療の有効性。 Life Sci. 2004;75(11):1323-32.

8. Wang XR, Xiao J, Sun DJ. ブタ心筋の虚血・再灌流に対する鍼治療と低体温療法の心筋保護効果. Acupunct Electrother Res. 2003;28(3-4):193-200.

12. Alva N, Palomeque J, Carbonell T. Ketamine/xylazine麻酔により誘導された一酸化窒素は低体温時の肝血流を維持する。 Nitric Oxide. 2006;15(1):64-9.

14. Lin JG, Chang SL, Cheng JT. ラット中湾ツボ鍼による副腎からのβ-エンドルフィン放出と血糖値低下作用. 神経科学レッツ.2002;326(1):17-20.

15. Lin JG, Chen WC, Hsieh CL, Tsai CC, Cheng YW, Cheng JT, Chang SL. ラット中湾点15Hz鍼による血糖降下反応に関与する内因性オピオイドペプチドの複数の情報源。 2004;366(1):39-42.

16. 世界保健機関(WHO). Standard Acupuncture Nomenclature: a brief explanation of 361 classical acupuncture points and their multilingual comparative list.標準鍼名法：361の古典的な鍼とその多言語比較リストの簡潔な説明。 2ed. WHO西太平洋地域事務所; 1993.

23. Xu Y, Osborne BW, Stanton RC. 糖尿病はPKAの活性化を介してグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの阻害を引き起こし、ラット腎臓皮質における酸化ストレスの一因となる。 Am J Physiol Renal Physiol 2005;289(5):F1040-7.

24. Salvemini F, Franzé A, Iervolino A, Filosa S, Salzano S, Ursini MV. グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼの発現増加を介したグルタチオンレベルの向上と酸化抵抗性。 J Biol Chem. 1999;274(5):2750-7.

25. Yu LJ, Lan, WZ, Chen C, Yang Y. 植物科学 2004;167:329-35.