自己乳化型セレコキシブ含有アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸カルシウム-キトサンビーズ

要旨

酸性環境下では薬物の放出を遅延させ、腸管区画では促進する経口投与用の薬物送達システムを得るために、自己乳化相に可溶なCelcoxib含有アルギン酸およびアルギン酸-キトサンビーズの開発を行なった。 この研究の目的は、celecoxibの治療効果を向上させ、胃の副作用を軽減し、大腸癌の予防や家族性ポリポージスの治療における補助薬としての使用を促進することであった。 このシステムは，直径の異なるニードル（400μmと600μm）を用いて，イオントロピックゲル化法によって調製された。 ビーズの形態，粒子径，膨潤挙動，pHの異なる水溶液中でのin vitro薬物放出性能を検討した。 その結果，キトサンの配合により，ビーズ構造の機械的抵抗が増加し，その結果，ビーズの膨潤性が制限され，中性pHにおける薬物放出速度が低下することが明らかとなった． アルギン酸-キトサンビーズはcelecoxibのコロニーデリバリーを保証する良いツールになる可能性がある。 はじめに

生分解性天然高分子を用いた薬物送達システムは、これらの材料が提供できる利点を考慮し、より多くの研究の対象となっている。 その中でも、アルギン酸とキトサンを含むものは、医薬品の分野で広く利用されています。

アルギン酸は褐藻類から抽出された水溶性の天然バイオポリマーで、1～4個のα-L-グルロン酸とβ-D-マンヌロン酸残基からなる交互のブロックから成ります。 このポリマーは、Ca2+、Ba2+、Sr2+、Zn2+などの2価の陽イオン存在下でハイドロゲルを形成し、この特性により薬物充填ビーズを調製することができる。 このゲル化のメカニズムは、グルロン酸残基がCa2+と特異的にキレートし、いわゆる「egg-box」構造を形成することにある。

キトサンは、D-グルコサミンとN-アセチル-D-グルコサミンがβ-(1-4)グリコシド結合した生体適合性、生分解性、無毒の直鎖多糖類であり、このビーズを用いた薬物送達システムは、薬物分子やたんぱく質を経口投与するために注目されている。 キトサンは甲殻類の殻に由来するキチンの部分的な脱アセチル化によって得られ、細胞培養、ドラッグデリバリー、食品添加物などに広く使用されています。

アルギン酸とキトサンを架橋したハイドロゲルは、医療および医薬用途に役立つ材料を提供するのに、単一ポリマーで得られたシステムよりも安定性が高いことが特徴となっています。 アルギン酸-キトサンの高分子電解質複合体は、ドラッグデリバリーの制御において近年非常に注目されている。 アルギン酸のカルボキシル残基とキトサンのアミノ残基がイオン的な相互作用によって高分子電解質複合体を形成している。 アルギン酸-キトサンビーズは、二段階法と一段階法という異なる方法で製造することができる。 第一の方法は、アルギン酸カルシウムの溶液をカルシウムイオンを含むゲル化浴に滴下して、アルギン酸カルシウムゲルのビーズを製造するものである。 このビーズをキトサン溶液に浸して膜を形成させる。 アルギン酸のゲル化剤（カルシウムイオンなど）とキトサンを含む水溶液にアルギン酸溶液を滴下する一段階方式である。 製造方法の選択は、得られる製品中の結合キトサンの量によって、ビーズの性質に影響を与える。 同時に、ビーズの特性は、選択したポリマーの分子量および/またはポリマー分子内の様々な残基の割合によって影響を受けます。

Celecoxib, フッ化ベンゼンスルホンアミド誘導体は、非ステロイド抗炎症薬（NSAID）であり、非常に選択的にシクロオキシナーゼ2 (COX-2) 阻害作用がある。 COX-2を触媒とするプロスタグランジン合成を阻害することにより、抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用を有する。 近年では、in vitroおよびin vivoモデルで抗がん作用が頻繁に研究されています。 前臨床試験では、頭頸部扁平上皮癌、大腸癌、乳癌、肺癌に対する優れた抗癌活性が報告されています。

本研究では、酸性環境では薬物の放出を遅らせ、腸管区画では放出を促進する経口投与用の薬剤送達系を得るために、自己乳化相に可溶化したセレコキシブ含有アルギン酸ビーズおよびアルギン酸-キトサンのビーズを開発しました。 この研究の背景には、celecoxibの治療効果を高め、胃の副作用を軽減し、大腸癌の予防や家族性ポリポージスの治療における補助薬としての使用を促進することがある。 本研究の目的は、セレコキシブ含有アルギン酸カルシウムビーズおよびアルギン酸カルシウム-キトサンビーズの特性を評価し、比較することであった。 ビーズの形態、粒子径、膨潤挙動、pHの異なる水溶液中でのin vitro薬物放出性能を検討した。 材料

Celecoxib はChemos GmbH (Regenstauf, Germany)から入手した。 無水塩化カルシウムおよびアルギン酸ナトリウム（分子量120000〜190000g/mol；マンヌロン-グルロン残基比1.56）はSigma Aldrich（イタリア、ミラノ）から購入し、低分子量キトサンはFluka（イタリア、ミラノ）より入手した。 Labrasol (caprylocaproyl macrogol-8 glycerides) は Gattefossè (Milan, Italy) から贈られた；TPGS (D-α-tocopheryl polyethylenglycol 1000 succinate) は Isochem (Gennevillers, France) から親切に寄贈された。 他のすべての化学物質は、分析グレードであった

2.2. アルギン酸カルシウムビーズの調製

アルギン酸カルシウムビーズは、架橋剤としてカルシウムイオンを用いたゲル化法により調製した。 具体的には、1.5%(w/w)のアルギン酸ナトリウム水溶液と薬剤を含む自己乳化相を4 : 1で混合し、100 mM CaCl2溶液に一滴ずつ添加した。 自己乳化相は、LabrasolとTPGSを50℃で混合し、celecoxibを賦形剤に溶解して調製したものである。 このエマルジョン（アルギン酸ナトリウム溶液と自己乳化相）を、内径400μmまたは600μmの針を通して、室温で穏やかに攪拌しながら、手動で硬化浴中に押出した。 15分後、ビーズを回収し、脱イオン水で洗浄して過剰のカルシウムイオンを除去し、その後40℃で一晩乾燥させた。 CAl 600およびCAl 400とコード化された、調製された製剤の組成を表1に記載した。

表1

2.3. アルギン酸カルシウム-キトサンビーズの調製

アルギン酸カルシウム-キトサンビーズ（CAlCh 600およびCAlCh 400として同定）を1ステップ法に従って調製した。 手順は、硬化浴が100mMの濃度のCaCl2を含む希釈酢酸（1％）中の0.2％（w/w）キトサン溶液であることを除いて、アルギン酸ビーズの場合に採用したものと同一であった。 キトサン製剤の組成は、表1に報告されている。 形態学的及び粒子サイズ分析

湿潤及び乾燥ビーズの形態及び乾燥ビーズの粒子サイズを、Motic SMZ168実体顕微鏡及び画像分析ソフトウェア（Motic Image Plus 2.0）を使用して分析した。 各製剤について、粒子径は20個の乾燥粒子のサイズの平均値として計算された。

2． 薬物含量

6ミリグラムの薬物担持乾燥ビーズを0.75% (w/v) ラウリル硫酸ナトリウムを加えたpH6.8のリン酸緩衝液（100mL）に70℃で2時間撹拌下に可溶化させました。 冷却後、得られた溶液を濾過し、255nmで分光光度計で分析した。結果は、少なくとも3回の測定の平均値である

2.6. 膨潤試験

異なるpHを特徴とする3つの水性媒体：pH1.0の塩酸、pH6.8およびpH7.4のリン酸バッファに入れた乾燥ビーズについて37℃で膨潤試験を行った。

正確な重量のアルギン酸カルシウムおよびアルギン酸カルシウム・キトサン乾燥ビーズを各液5mLのガラスバイアルに投入した。 一定時間後(5, 15, 30, 60, 120分)にサンプルを回収し、ペーパーで軽く拭き取った後、再度重量を測定した。 時間に対するビーズの動的重量変化は、膨潤度（Sw）として定義され、以下の式に従って計算された：ここで、時間における膨潤状態のビーズの重量であり、乾燥ビーズの初期重量である

2.7. セレコキシブ放出試験

in vitro放出試験は、pH1.0の塩酸とpH6.8のリン酸緩衝液で行い、pH7.4で0.75%のラウリル硫酸ナトリウムを加えて、シンク条件の維持を保証した。 試験は、セレコキシブ8 mgに相当する各製剤を500 mLの選択液中に正確に秤量し、37℃、100 rpmの回転速度で行った（装置2、パドル）。 ろ過した試料を特定の時間間隔で交換せずに取り出し、UV分光光度計を用いて、液体が塩酸とpH6.8のリン酸緩衝液の場合は255nmで、pH7.4のリン酸緩衝液の場合は256nmでセレコキシブ含有量を分析した。 各実験は三重で行いました。

アルギン酸カルシウムとアルギン酸カルシウム-キトサンビーズの薬物放出性能は、薬物の10%、50%、90%が放出された時点を示す溶解パラメータt10%、t50%、t90%とf2類似性パラメータを用いて比較されました。 曲線が類似していると見なされるには、f2値が100に近い必要があり、50より大きいf2値（50-100）は、2つの曲線の同一性または同等性を保証します

2.8. 統計解析

結果は、95％信頼区間で、スチューデントのt検定によって有意差を検定するために統計的に分析された。

3.統計的に有意であるとみなされた値未満0.05。 結果および考察

アルギン酸およびアルギン酸-キトサンビーズは、塩化カルシウムまたは塩化カルシウム-キトサンゲル化浴中で23G（600μm）または27G（400μm）の針を通してアルギン酸水溶液と薬剤負荷自己乳化相からなる乳剤を滴下するイオン性ゲル化法によって得られた。 自己乳化相の賦形剤としては、自己乳化作用と溶解性向上作用を有する液体成分であるLabrasolと、共乳化作用と吸収促進作用を有するD-α-トコフェリルポリエチレングリコール1000スクシネートを選択した（Table 1）。 自己乳化相の組成は以前の研究で使用したものと同じである。

アルギン酸およびアルギン酸-キトサンビーズの湿潤および乾燥状態の実体顕微鏡画像を図1および2に報告する。 調製直後のCAl 600ビーズ（図1（a））は規則的な形状と均質な寸法を示し、白色で不透明、滑らかで光沢があり均質な表面を有している。

(a)
(b)
(c)
(d)

乾燥過程では、ビーズの形状は変化しないが、寸法の縮小につながり、不規則でしわの多い表面の特性が変化する（図1（b））。 水分が失われると、高分子鎖間の距離が縮まり、ビーズの構造が変化する。ビーズはコンパクトで連続したものではなく、小さな微小核が互いに付着した構造になっている。 完全に膨潤したCAlCh 600粒子は、わずかに黄色でかなり規則的な形状をしており、滑らかな表面を示している（図1（c））。 この場合，乾燥工程はビーズの球形に影響を与える（図1（d））。ビーズは楕円形になり，その寸法は減少し，その表面は非常に粗くなっている。 さらに、乾燥後、ビーズの表面の部分的な凝集が観察されるが、これはキトサンの粘着性に起因するものである。 400μmの針で調製したビーズ（図2（a）-2（c））の場合、調製直後に記録した画像から、両方の製剤（キトサンを含むまたは含まない）について、粒子の形状が規則的であっても直径が均一でないことが証明されました。 CAl 400とCAlCh 400乾燥ビーズ（図2（b））は、アスペリティと凹みによって特徴付けられる表面を有する。さらに、アルギン酸-キトサン製剤の場合、粒子形状は完全に不規則で、ビーズを結合するキトサンの固体橋の存在がよくわかり、分離を阻害した。 ビーズの直径は、調製時に使用した針の直径に大きく影響された()。 アルギン酸ビーズにキトサンを添加すると、400μmの針を使用した場合のみ、その寸法が大きく変化する()。 さらに、標準偏差の高い値によって示されるように、400μmの針を使用すると、最終生成物は寸法が不均一な粒子のファミリーである。

すべての製剤は、賦形剤マトリックスに均一に分布した多量の薬物を含み（表2）、CAlCh 400が他よりわずかに低い（）以外は、それらの薬物含量の間に有意差はなかった。 ビーズ中のセレコキシブの割合は理論値を超えており、これは硬化中にLabrasolが失われたためであり、この賦形剤と水の親和性が高く、ビーズからゲル化槽に追い出されることを考慮すれば妥当な結果であると言えます。

乾燥形態のアルギン酸またはアルギン酸-キトサン微粒子システムの特異な特性は、水性流体と接触した後、再水和して流体を取り込み、主にポリマーの親水性基の水和に関連した膨潤プロセスを経る能力です。 流体が水である場合、それは高分子鎖の間の孔を埋める粒子の中に浸透し、浸食/崩壊することなく、システムの重要な膨潤を引き起こします。 pHの異なる流体を選択すると、ビーズの膨潤挙動が変化する可能性がある。 このため、アルギン酸カルシウムおよびアルギン酸カルシウム-キトサンビーズの膨潤性を、pH1.0の塩酸、pH6.8と7.4のリン酸緩衝液で評価した（図3-5）。

酸性環境（図3）では、4つの製剤の膨潤能力に違いはありません。このpHでは、最大膨潤度は60％を超えることはありません。 アルギン酸およびアルギン酸-キトサンビーズは液体を一部吸収し、その重量は最初増加し、その後一定に保たれます。 このpHでは，アルギン酸系（CAl 600およびCAl 400）では，粒子表面に局在するポリマーのカルボキシレート基がプロトン化され，アルギン酸の層が形成される。 この液に対するアルギン酸の不溶性と水素結合の形成が構造安定性の向上に寄与し，粒子深層部への液の浸透を妨げ，膨潤を制限する。 CAlCh 600とCAlCh 400の系でも同じような膨潤挙動が観察された。 たとえ，酸性環境下でキトサンが高度に溶解し，そのアミン単位がNH3+可溶性形態に変換するために帯電したとしても，アミノ基とプロトン化したカルボキシル基の相互作用は膨潤を促進するほど強くはない。 したがって、限られた全膨潤挙動はアルギン酸カルシウム構造によって支配されている。

図4および図5は、製剤がpH 6.8およびpH 7.4で高い膨潤能力を示すことを示している。 CAl 600製剤では，粒子重量が急速に増加し，30分後にピークに達した後，系の浸食/崩壊のため急激に減少した。 この挙動は、アルギン酸のカルボキシル基に結合したNa+（リン酸緩衝液中に存在）とCa2+のイオン交換反応に起因すると考えられる。 一価のイオンが二価のイオンに置き換わり、「卵箱」構造の崩壊と高分子鎖間の距離の増大が起こり、液体の吸収と系の膨張が促進されるのである。 このプロセスは、ビーズへの浸透圧が、ビーズの構造を維持する架橋結合と物理的な絡み合いの強さと釣り合うまで続く。

膨潤試験から得られた結果は、CAlCh 600およびCAlCh 400ビーズが、CAl 600およびCAl 400と比較してより抵抗性の高い構造を特徴とすることを証明しており、おそらくアルギン酸およびキトサン鎖間の相互作用に起因していると考えられます。 キトサンビーズの最大膨潤度はアルギン酸よりも低く、アルギン酸-キトサン系は約30分で膨潤平衡に達し、試験終了までその重量を一定に保つことができる。 おそらく、2つのポリマー間の相互作用が、かなりの機械的抵抗を持つ粒子の形成に関与し、これが液体の吸収と構造の崩壊を制限しているのであろう。 最後に、CAl 400対CAl 600およびCAlCh 400対CAlCh 600ビーズ（同じ組成、調製プロセスで使用した針の直径が異なる）の膨潤挙動を比較すると、リン酸緩衝液ではCAl 400およびCAlCh 400がそれぞれCAl 600およびCAlCh 600の膨潤最大ピークより高くなったことに注目できます

pH 1.0, 6.8, 7.4 で異なる処方から得られた薬剤放出プロファイルは図6-8に示されています。 in vitroでのセレコキシブ放出は、選択した液のpHに影響される。酸性媒体で2時間に放出される薬物の割合はかなり低く、12.70%から24.53%の間で変動する(図6)。 ビーズの組成や直径は薬物放出性能に影響を与えない（f2パラメータ値は常に50以上）。 pH1.0では、放出プロセスは薬物の拡散によってのみ支配される。 この結果は、本研究の第一の目的である酸性環境下での薬物送達を最小限に抑え、腸管レベルでのこのプロセスを促進・促進することを可能にするものである。

pH 6.8のリン酸緩衝液では、製剤はその組成に影響され、寸法にはあまり影響されない薬剤放出挙動によって特徴付けられる(図7)。 この流体では、システムは最初に膨張し、次に侵食/崩壊し、その結果、薬物放出プロセスは最初は拡散により、次にポリマーの緩和により駆動される。 アルギン酸ビーズ（CAl 600とCAl 400）は約8時間でcelecoxibの放出を完了することができた。一方、アルギン酸-キトサンビーズに充填した薬物は同じ時間で75%以上溶液中に移行することはなかった。 アルギン酸とアルギン酸-キトサンの微粒子製剤の結果を比較すると、f2値が50より低く、プロファイルは類似していないことがわかる。 このような挙動を説明できるのは、アルギン酸のカルボキシル基とキトサンのアミノ基の間の静電的相互作用が、ポリマーネットワークの機械的抵抗を向上させ、pH6.8での膨潤と侵食を減少させているためと思われる。 おそらく、これらの粒子の小さな直径と高い表面積は、ビーズの周りに厚いキトサン層の形成につながり、液体の取り込みに大きな抵抗となり、結果として薬物放出に反対する。

pH 7.4でも薬物放出性能の違いは、粒子寸法よりも製剤組成に起因することができます（図8）。 すべての製剤は、ほぼ一定の薬物放出速度を示した。 CAl 600とCAl 400、CAlCh 600とCAlCh 400の放出曲線に違いはありません。キトサンがビーズに含まれる場合、薬物放出率は低下します。

同じ結論が、溶解パラメータ（t10%、t50%、t90%）を通して薬物放出の結果の分析によって示されます（表3）。 ビーズの放出挙動の違いは、溶解パラメーターt10%、t50%、t90%を通しても検出され、担持された薬物の50%と90%を放出するのに必要な時間についてよくわかる。 リン酸緩衝液中では、アルギン酸キトサンビーズはアルギン酸ビーズと比較して、セレコキシブを50%および90%放出するのに長い時間を必要とした。 おそらく、アルギン酸-キトサン複合体の存在が、ビーズ構造のしわ、不規則性、複雑性を増大させ、薬物の放出を困難にしているのであろう。