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米国食品医薬品局

細菌分析マニュアル（BAM）メインページ

著者紹介 サンドラ・M・タレント、レジナルド・W・ベネット、ジェニファー・M. Hait

改訂履歴：

  • June 2017 – New Chapter 13B was added to the Bacteriological Analytical Manual
  • January 2018 – Hyperlink for CDC APHIS/CDC Form 4 corrected

ブドウ球菌食中毒（SFP）は形成前腸毒素で十分に汚染された食物を摂取して起こる中毒症状である。 SFP の症状は、摂取後 2 ～ 8 時間以内に現れ、下痢を伴うまたは伴わない吐き気、嘔吐、腹部けいれんを含み、通常 24 ～ 48 時間以内に消失します。 (Argudin et al., 2010)。 SFPの影響を受ける人の数は、誤診や報告されていない小規模な発生により、推定値に過ぎません。 入院はまれですが、免疫力が低下している人、特に高齢者や非常に若い人での発症が指摘されています (Scallan et al., 2011)。

ブドウ球菌は通常、人の皮膚や粘膜に存在し、約20～30%が持続的に、60%が断続的に定着しています (Kluytmans et al.、2005年)。 腸内毒素原性ブドウ球菌に感染している食品取扱者は、製品または接触面に直接接触することにより、食品汚染の主な原因となると考えられています。 乳牛などの動物もブドウ球菌を保有しており、牛乳や乳製品の汚染源となる可能性があります。 最後に、環境中に存在するブドウ球菌が食品に移行し、潜在的な汚染源となることがあります (Gutiérrez et al., 2012)。

SFP によく関連する食品には、加工食品、肉、鶏肉、乳製品、ベーカリー製品などが挙げられます。 食品が汚染されると、特に、冷蔵保存条件や低温殺菌などの熱殺菌工程など、増殖を防ぐ適切な製造条件が守られていない場合に、ブドウ球菌の増殖や腸内毒素の生成が起こります (Gutiérrez et al., 2012)。 ブドウ球菌の腸内毒素は熱に安定で、高温に長時間さらされない限り変性しない、すなわち。 黄色ブドウ球菌は、ブドウ球菌による食中毒の発生に最もよく関連していますが、S. hyicus や S. intermedius などの他の腸内毒素コアグラーゼ陽性ブドウ球菌も、発生に関与しています (Hennekinne et al., 2010)。 ブドウ球菌のエンテロトキシン（SE）は、超抗原性活性を持つ発熱性外毒素です。 腸内毒素は、熱やプロテアーゼに耐性を持つ球状タンパク質で、分子サイズは平均約25 kDaである。 病気を引き起こすのに必要な毒素の量は、非常に少ないと推定されている。 チョコレートミルクに関連したある集団発生では 0.5ng/ml の SEA が検出され (Evenson et al., 1988)、粉ミルクに関連した集団発生では 0.38ng/ml の SEA が検出された (Asao, et al., 2003)。

古典的 SE (SEA-SEE) および非古典 SE、SEG、SEH、SEI、SER および SET には催吐活性が証明されています。 SE様エンテロトキシンSElJ-SElQ、SElS、SElU、SElVの催吐活性はまだ証明されていない。 すべてのSEおよびSEL遺伝子は、バクテリオファージ、病原性アイランド、プラスミドまたはトランスポゾンを含む移動性遺伝要素上に位置している（Argudin et al.、2012）。 SEの検出方法は、SEA-SEEを検出する抗体を用いた市販の多価酵素結合免疫測定法（ELISA）または酵素結合蛍光免疫測定法（EFLA）に依存している。 一価の方法はSEA-SEEに特異的であり、これらのタイプを区別するために使用することができる。 この方法では、分析前に疑わしい食品からエンテロトキシンを抽出する必要があります。 食品抽出物を透析濃縮することで、メソッドの感度と選択性が向上しますが、時間の制約から濃縮せずに予備検査を行う必要がある場合もあります。 しかし、透析濃縮は分析前にすべての乳製品に対して行う必要があります (Hennekinne et al., 2012)。

CAUTION: ブドウ球菌腸毒素は非常に有毒で、エアロゾルが発生する可能性のある手順は、承認された生物学的安全キャビネット (BSC) で実施する必要があります。 Staphylococcal Enterotoxins（SEA、SEB、SEC、SED、およびSEE）は選択薬剤です。 科学者はCDCによって確立されたガイドラインに従わなければなりません。 https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. 特別な設備と材料
    1. 温度調節された部屋または冷蔵庫 2～8°C
    2. ブレンダーまたはホモジナイザー
    3. インキュベーター 35～37°C
    4. 分析天秤および計量ボート
    5. 透析用トレイ
    6. pHメーター.が必要です。 抽出時のpHと抽出に使用する緩衝液のpHが重要です。
    7. 冷蔵遠心機 2～8℃、
    8. 実験器具は毒素の吸着を避けるため、ガラスまたはポリプロピレン製。
    9. フィルタークロスは遠心分離後のカスを集めるために使用する。 多くの場合、あらかじめ湿らせた粗いチーズクロスを数枚重ねてこの作業を行う。
    10. 分液漏斗
    11. 透析膜 MWCO 6,000-8,000 Daltons（例：Spectra/Por®、クロージャー付き）平膜幅23±2mm。
    12. 腸内毒素のエアロゾル化を避けるための安全対策として、液体培養上清のろ過には、Steriflip（EMD Millipore）などの真空コニカル管ろ過装置（0.22μm膜）を推奨する。
    13. 生物学的安全キャビネット
  2. 試薬

    注意：キットメーカーにより異なる緩衝液や溶媒が必要な場合があります。

    1. リン酸緩衝液（PBS溶液） pH7.3 + 0.2（NaCl/Na2HPO4：145 mM/10 mM） PBS1Lは、9 g NaCl と 3.58 g Na2HPO4を蒸留水1Lに溶解して調製してください。 809>
    2. 塩化ナトリウム (NaCl)
    3. リン酸ナトリウム (Na2HPO4)
    4. Polyethylene glycol (PEG) (20,000 mol wt) 70 ml 蒸留水に対して 30 g PEG を加え 30% (w/v) PEG 溶液を作製する。
    5. 1 N (または 0.1 N) NaOH.
    6. 1 N (または 0.1 N) HCl.
  3. 透析膜の調製
    濃縮する食品エキスが入る長さに透析膜をカットし、透析膜の長さを決める。 チューブを蒸留水2回に浸し、グリセロールを除去します。 メンブレンクロージャーを使用するか、チューブの片端を2つ結びにして密着させる。 チューブを蒸留水で満たし、開口部をしっかりと閉じた状態で満杯の袋を圧迫して漏れがないかどうかテストする。
  4. Extraction of Enterotoxin from Food Portion

    NOTE: この手順および病原性微生物やエンテロトキシンのエアロゾルを生成する可能性のある他の手順は、承認されたバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。

    1. 可能な場合、食品全体または製品の代表サンプルを選択し、ミキサで粉砕してサンプルを均一化し、食品中のSEが均一に分散するようにします。
      1. 表皮のあるチーズの場合、表皮10%、チーズ90%のサンプルを採取します。
      2. 乾燥製品の場合、製品と同量の水を使用してブレンドするか、メーカーの指示に従います。
    2. ガラスビーカーでサンプル25gを計量して、蒸留水40mlと共にテスト部分をブレンダーに移して高速で3分間ブレンドすると、均一なスラリーが生成されます。
    3. 室温で30分間振とうし、毒素を拡散させる。
    4. 混合物を0.1N HClでpH3.5から4.0に酸性化させる。
    5. 酸性化したスラリーを50mlのコニカルチューブに移し替える。 遠心（3,130×g, 20分, 5℃）する。 低速で遠心時間を長くすることも可能ですが、食品によってはクリアランスが悪くなります。
    6. 上澄み液は、漏斗に入れたチーズクロスなどの濾材を通して800mlビーカーに移す。 上澄み液が透明でない場合は、再度遠心分離し、チーズクロスを用いて上澄み液をデカントする。 pH は 3.5 から 4.5 の間であるべきです。 pHが正しい場合、0.1N NaOHで中和し、pHを7.4から7.6の間にする。
    7. pH が >4.5 の場合は酸性化を繰り返し、<3.0 または >9.0 の場合は別の25 gの食品部分で処理を繰り返し行う。
    8. 繰り返し検査に十分なサンプルがある場合、バリデーションされたアッセイ（セクションHを参照）を使用してスクリーニングするためにアリコートを取り出すことが可能です。
  5. 透析による抽出液の濃縮
    1. 用意した透析用袋に抽出液を入れる。 トレイに密封した袋を置き、30%(w/v) PEGに浸漬する。 5℃で15～20ml以下になるまで静置する。 この作業は24～72時間かかるが、一晩保持しても容量が減少しない場合は、トレイに粉末のPEGを追加する。 PEGから袋を取り出し、外側を水でよく洗い、袋に付着しているPEGを除去する。 蒸留水に1～2分浸す。
    2. 嚢の内側を2-3mlの蒸留水（牛乳や乳製品にはPBSを使用）で、嚢の外側を指で上下に動かし、チューブの側面に付着している物質を落とします。 リンス液が透明になるまでリンスを繰り返す。
    3. 抽出液のpHを7.4-7.6に調整する。
    4. 濃縮抽出液は48時間以内に分析し、3-5℃で保存する。さもなければ、抽出液を18-20℃で冷凍し、検査の前に3-5℃で完全に融解する。
  6. 細菌培養液からのSEの検査

    腸管毒素を産生する疑いのあるブドウ球菌株は、TSBやBHIなどの栄養ブロスであらかじめ濃縮することができます。

    1. 形態的に似た2、3個のコロニーを10mLの栄養ブロスに移し替えて、その中に含まれるSEの濃縮をします。
    2. 35-37℃で一晩、オービタルシェーカーで培養する。
    3. 遠心分離 5分 3500×g、10℃
    4. 上清をSteri-Flip vacuum filter device with a 0.22µm filter or other closed systemを使ってろ過し、腸管毒素が飛散するのを防止する。 この手順は、科学者の安全を確保するために生物学的安全キャビネット内で行わなければなりません。
    5. 培養上清は、キットの線形範囲外の高濃度のSEを持つことがあり、PBSで希釈する必要があります。
  7. 結果の報告

    食品中に検出されたブドウ球菌エンテロトキシンの存在は、疾病管理予防センター（CDC）によって管理されている連邦選択薬剤プログラムへ報告されなければなりません。

    陽性結果は、Staphylococcal entertoxoin detected in × g (ml) of product として報告されるものとする。

  8. 注意事項

    キットは最低0.05ng/gで、相対感度（>90%）及び相対特異度（>90%）でエンテロトキシンを検出できなければならない。

    本法における商品名または市販品の記載は、科学的な情報提供のみを目的としており、米国食品医薬品局による推奨または推奨を意味するものではありません。 SEA-SEEを検出する自動多価酵素連結蛍光測定法（EFLA）であるAOAC承認のVidas SET2（bioMerieux, Inc）（AOAC Official Method 2007.06 VIDAS SET2 for Detection of Staphylococcal Enterotoxin in Select Foods, Final Action, 2010）などが、一般的なSE検出法として使用されています。 現在、Vidas Set2 のカタログ番号は Ref. 30705. Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) は、多価抗体を塗布したウェルで行う手動酵素連動免疫測定法である。 多価のリダスクリーンキットは、ブドウ球菌のエンテロトキシンSEA-SEEを検出し、欧州標準化委員会（CEN）指令のISO規格19020のコアグラーゼ陽性ブドウ球菌の欧州連合基準研究所が主導するリング試験と第三者検証試験により検証されました。 一価のキットとして、Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) がありますが、このキットは第三者機関によるバリデーションは行われていません。 セットトータルの多価キットのカタログ番号はR4105（96テスト）またはR4106（48テスト）です。 SET A,B,C,D,E 一価キットのカタログ番号は R4101です。

干渉

食品中にラクトパーオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの内在性酵素があると非特異反応が起こり、Vidas SET2などのアルカリホスファターゼを検出酵素とするキットは干渉します (Vernozy-Rozand, et al., 2005)。 すべての陽性結果は、異なる検出酵素を使用する代替法で確認することが推奨されます。 Vidas SET2の場合、代替法としてラクトペルオキシダーゼを用いるRidascreen SET Totalがあります。

サンプルから内因性アルカリホスファターゼを除去するために以下のように熱処理を行うことがあります：

  • 濃縮エキス600μLをチューブに移す
  • 80℃で2分間加熱
  • 冷ました濃縮エキスでVidas SET2法を再度行う。 809>

ライドスクリーンなどラクトペルオキシダーゼを用いるキットで不正確な結果が予想される場合、濃縮エキス100μLをチューブに移し替えてください。 基質とクロマゲンキットの溶液をそれぞれ50μLずつ加えます。 混合し、青緑色の発色を確認する。 青緑色が現れた場合、内在性ラクトパーオキシダーゼがサンプル中に存在し、アッセイに干渉していることを示します。

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