真菌の二型性と病原性(Fungal Dimorphism and Virulence): Molecular Mechanisms for Temperature Adaptation, Immune Evasion, and In Vivo Survival

Abstract

熱二形性真菌は子嚢菌門の中でユニークなグループの真菌で、温度のシフトに対応して菌糸 (22-25°C) と酵母 (37°C) を転換させる。 相転移と呼ばれるこの形態変化は、これらの菌類の生物学的および生活様式を定義している。 健康な哺乳類および免疫不全の哺乳類宿主における酵母への転換は、病原性を発揮するために不可欠である。 酵母相では、熱二型菌は宿主の免疫防御を阻害する遺伝子を増加させる。 本総説では，相転移を支配する分子機構と，相転移が感染を促進するメカニズムに関する最近の進歩に焦点を当てる。 はじめに

真菌の異なる形態間の切り替え能力は、真菌界全体に広く存在し、その生物学の基本的な部分である。 子嚢菌門の一部の菌類は、酵母と菌糸の2つの特定の形態間で変換する能力を持つ二形性菌と考えられている。 これらの菌は、哺乳類、植物、昆虫に感染することができ、熱性二型菌と非熱性二型菌に分類される。 熱性二型菌は、ヒトをはじめ、イヌ、ネコ、アルマジロ、げっ歯類などの哺乳類に感染する（表1）。 熱性二型真菌は、正常な免疫防御力を持つヒトにも、免疫防御力が低下したヒトにも感染することができるため、真菌病原体の中ではユニークな存在である。 これには、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、スポロトリコーシスの病因菌が含まれる。 一方、ペニシリン症やエモンシ症は、AIDSに進行した長期間のHIV感染者（CD4+ T細胞/mm3）や他の理由（固形臓器移植など）で細胞媒介免疫が損なわれた人に発生する。 非熱性二型真菌もヒトへの感染を引き起こすことがあるが（例えば、Malassezia furfur）、より一般的には植物病原性または昆虫病原性である。 例えば、Ophiostoma novo-ulmi はオランダニレ病の原因菌で、ヨーロッパとアメリカで数百万本のニレの木を破壊している。 ゾンビアリ」菌であるOphiocordyceps unilateralisは、代謝物を分泌し、感染したアリの行動を変化させる。 本総説では、菌糸と酵母の形態的な切り替えがどのように病原性に寄与しているのか、ヒトの健康に関連する熱二型菌に重点を置いて解説する。

2 相転移

相転移と呼ばれる菌糸と酵母の間の可逆的な形態変化は、二形菌の生態とライフスタイルの基本的な特徴である。 土壌中（22〜25℃）では、これらの菌は分裂菌糸として成長し、分生子を生産する。 建築などの人間活動や自然災害によって土壌が破壊されると、分生子や菌糸片が飛散することがある。 哺乳類の肺（37℃）に吸い込まれると、これらの菌は病原性酵母（Coccidioidesは球形）に変化し、肺炎を引き起こす。

相転移を左右する主な刺激は温度で、菌体は22-25℃、酵母は37℃であるが、二型転移に影響を与えるその他の刺激としては、二酸化炭素（CO2）張力、外来システイン、エストラジオールなどが挙げられる。 Coccidioides spp.の関節子虫が37℃で球形に発芽し、Histoplasma capsulatum酵母が任意に増殖するためには、高い二酸化炭素濃度（5％二酸化炭素）が必要である 。 ヒトの肺では、CO2張力は大気中の約150倍であり、相転移に最適な量のCO2を供給している . ヒストプラスマ、ブラストマイセス、パラコクシジオイデスでは、温度の上昇に伴い、ミトコンドリア呼吸が停止する。 呼吸を再開させ、酵母への形態変化を完了させるには、外因性のシステインの取り込みが必要である。 ヒトの17β-エストラジオール産生はCoccidioidesとParacoccidioidesの形態学的変化と増殖に影響を与え、その結果、女性における感染の重症度を調節する。 17β-エストラジオール存在下では、37℃におけるコクシジオイデス球状体の成長が加速され、これが妊婦における播種性コクシジオイデス症のリスク上昇を説明する可能性がある . さらに、in vitro の解析により、コクシジオイデス球状体は 17β-estradiol と飽和結合することが明らかになった。 一方、パラコクシジオイデスでは、菌糸や分生子から酵母への形態変化は17β-エストラジオールによって阻害される。 マウス肺感染モデルにおいて、雌マウスでは分生子から酵母への転換が阻害されるが、雄マウスでは阻害されない。 ヒトでは、パラコクシジオイデスへの曝露頻度が同程度であるにもかかわらず、パラコクシジオイデス症の発生率は成人男性で成人女性より11-30倍高いことが分かっている。 思春期以前の男女比は1：1であり，エストラジオールや性別が真菌の発生や宿主の反応にどのような影響を与えるかについて検討した。 P. brasiliensis Pb01株の遺伝子発現マイクロアレイ解析により、17β-エストラジオール存在下、37℃での酵母への変換障害により、細胞シグナル伝達（small GTPase RhoA, palmitoyltransferase）、熱ショック（HSP40、HSP70、HSP90）、キチン合成（キチン合成酵素）、グルカンリモデルに関わる遺伝子（β-1，3-グルカンシンターゼ、α-1，3-グルカンシンセラーゼ）の転写低下が起こることが示された。 キチナーゼ活性を有するレクチン結合タンパク質であるパラコシンで刺激すると、雌マウスは雄マウスと比較して、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターフェロンγ（INF-γ）、インターロイキン12（IL-12）の産生が増加し、マクロファージの殺菌活性が増加するというTh1サイトカイン反応が強く見られるようになった。 卵巣摘出とテストステロン投与により、メスマウスのサイトカイン反応はTh1からTh2へと変化した。 雄マウスの去勢とエストラジオール療法は、Th2サイトカイン反応ではなく、Th1サイトカイン反応を促進させた。 これらの結果から、真菌の発生と宿主の感受性には、性ステロイドホルモンと性別が重要であることが明らかになった。 Histoplasma capsulatum，Coccidioides immitis and posadasii，Sporothrix schenckii，Paracoccidioides brasiliensis and lutzii，Talaromyces marneffeiは自然免疫細胞の内部や外部で複製を行う． 従来、ブラストミセス属菌は細胞外にのみ存在すると考えられていたが、最近の研究では、マクロファージに摂取されたB. dermatitidis分生子が生き残り、酵母に変化することが証明されている …

相転移の際、熱二型菌はBlastomyces adhesion-1 (BAD-1), calcium-binding protein-1 (CBP1), yeast-phase specific-3 (YPS3), and spherule outer wall glycoprotein (SOWgp) など酵母相特有の遺伝子をupregulateし、宿主免疫防御を活発に阻害していることが分かった。 B. dermatitidisとB. gilchristiiは、BAD1（旧WI-1）という120kDAの分泌型多機能タンパク質を発現し、接着と免疫回避の役割を担っている。 分泌されたBAD1は、キチンとの相互作用によって酵母の細胞表面に再び結合し、細胞外環境では可溶性を維持します。 細胞表面に結合したBAD1は、補体レセプター (CR3, CD14) とヘパラン硫酸を介して酵母を宿主細胞に結合させ、酵母細胞の宿主細胞への接着を促進する。 酵母細胞表面に結合したBAD-1は、マクロファージや好中球によるTGF-β（transforming growth factor-β）依存的にTNF-αの産生を阻害する。 一方、可溶性BAD-1は、TGF-βとは無関係にTNF-αの産生をブロックする . TNF-αは、二型真菌に対する適切な宿主防御のために重要なサイトカインである。 マウス感染モデルでTNF-αを中和すると、肺ブラストミセス症が進行する. さらに、2008年、FDAは、自己免疫疾患（関節リウマチやクローン病など）の治療のためにTNF-α阻害剤を使用している人に、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、コクシジオイデス症のリスクが増加するという警告を発表した。 TNF-α生産に影響を与えることに加えて、BAD1はまた、CD4+ Tリンパ球の活性化を阻害することによって適応免疫応答を損ない、IL-17とINF-γの生産を減少させる . BAD1の接着および免疫調節活性は、Blastomycesの病原体形成に不可欠である。 BAD1の欠失は、マウス肺感染モデルにおいてブラストミセス酵母を無菌化する。 BAD1に加えて、Blastomyces dermatitidisは、Dipeptidyl-peptidase IVA (DppIVA)を分泌し、宿主の免疫力を調節している。 DppIVはセリンプロテアーゼで、マクロファージや好中球を活性化して真菌を殺す強力なサイトカインであるGM-CSFを切断する。 DppIVAをRNA干渉により不活性化すると、GM-CSFで活性化されたマクロファージや好中球と共培養したB. dermatitidis酵母の生存が減少する。 さらに、DppIVA-RNAi株は肺感染時の病原性を減弱させた。 B. dermatitidisとは異なり、H. capsulatumのDppIVAは細胞外には検出されず、病原性には寄与しない。

BAD1に類似したCoccidioides SOWgpは球状細胞の表面に局在し、重要な病原性因子とされている。 SOWgpは球状体が宿主の細胞外マトリックス（ECM）タンパク質（ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲンなど）に結合するのを促進する。 SOWgpの欠損はECMタンパク質への球体の接着を損ない、マウス肺感染モデルにおいて病原性を減弱させる。

H. capsulatumにおいて、CBP1は酵母の細胞内複製を促進する分泌性の病原性因子である 。 CBP1はカルシウムと結合し、ホモダイマーとして存在し、プロテアーゼ分解に強く、構造的にはサポシンと呼ばれる膜脂質結合タンパク質のグループと関連している。 H. capsulatum酵母が細胞内に分泌するCBP1は、宿主細胞のカスパーゼ、転写因子（NUPR1/p8、TRB3）、小胞体ストレスに関わる遺伝子の転写を誘導し、マクロファージのアポトーシスと溶解を誘発する。 このように、マクロファージの溶解は、細胞内の真菌の負荷が大きいためではなく、真菌によって指示される能動的なプロセスである。 BAD1と同様に、CBP1は必須の病原性因子である。 CBP1欠損変異体（CBP1Δ）は、マクロファージのアポトーシスを誘導することができず、マウス肺感染モデルにおいて無病性であった。 H. capsulatumはCBP1に加え、酵母細胞壁のキチン質に結合して肝臓や脾臓への肺外播種を促進するYPS3を分泌する。

菌糸から酵母、分生子から酵母へと形態が変化する過程で、二型菌はグルカン組成など細胞壁の広範囲なリモデリングを行う。 グルカン組成の再編成は、宿主免疫細胞による病原体関連分子パターン（PAMPs）の認識を阻害する可能性がある。 ブラストミセスやパラコクシジオイデスでは、形態変化する際に細胞壁中のβ-(1,3)-グルカン量が菌糸の約40%から酵母の約5%に減少することが分かっている。 酵母細胞壁中のβ-(1,3)-グルカンの減少は、自然免疫細胞上のデクチン-1やマンノース結合レクチンによる認識を制限している可能性がある。 一方、H. capsulatumは、酵母細胞中のβ-(1,3)-グルカンを減少させず、α-(1,3)-グルカンを「盾」として、β-(1,3)-グルカンのdectin-1認識を阻害している . このように、二形性真菌は分泌型病原因子や酵母細胞壁の改変など複数の戦略を駆使して、宿主の免疫防御を攪乱し、免疫系が無傷の人を含めて感染を成立させる。

熱性二形性真菌の宿主免疫防御の攪乱能力は、100％有効ではない。 宿主は感染の進行を止めるために免疫反応を起こすことができる。 疫学的研究により、ブラストミセス属菌に暴露された人の約50％が症状を伴う感染を起こすが、約50％は無症状または不顕性感染であることが証明されている。 同様に、Histoplasma capsulatum、Coccidioides spp.、Paracoccidioides spp.の吸入により、それぞれ健常者の<10％、33-50％、<5％に有症状感染が発生する。 このような感染症に対する宿主の防御には、自然免疫と適応免疫の健全性と、肉芽腫における酵母の「壁打ち」能力が重要である。 分生子から酵母への変換後、樹状細胞とマクロファージは酵母細胞と相互作用し、酵母細胞を取り込む。 P. brasiliensis酵母を貪食した樹状細胞の遺伝子発現解析から、TNF-α、IL-12、ケモカイン（CCL22、CCL27、CXCL10）などの防御免疫反応に関わる転写産物の発現上昇が確認された。 さらに、β-(1,3)-グルカンと結合すると、貪食、活性酸素の生成、炎症性サイトカインやケモカインを誘導するデクチン-1受容体の発現が上昇することが示された。 ケモカインは感染部位への白血球の遊走を促進する。 同様に、P. brasiliensisに感染したマクロファージは、TNF-α、ケモカイン（CCL21、CCL22、CXCL4、CXC11、CXCL14）、キナーゼ（IRAK2）を上昇させて炎症性反応を引き起こす . このようなことから、真菌の病原性因子による影響を免疫防御が抑制していることが明らかになった。 ブラストミセスとヒストプラスマのDRK1にコードされるハイブリッドヒスチジンキナーゼの発見は、酵母への形態転換が病原性に直結していることを初めて遺伝学的に証明した。 DRK1 ヌル変異体、挿入変異体、RNA 干渉阻害株は、37℃で酵母の代わりに菌糸として成長し、BAD1 や CBP1 などの酵母期に特異的な病原性因子を発現せず、マウス感染モデルでも無病性であった。 DRK1の機能は、温度二型の真菌類の間で保存されている。 T. marneffeiでは、DRKA（DRK1ホモログ）がマクロファージ内で分生子から酵母への変換に重要である 。 Sporothrix, Paracoccidioides, T. marneffeiでは、DRK1の転写量は菌糸内（25℃）よりも酵母内（37℃）で多くなっている。 DRK1は、高浸透圧グリセロール（HOG）シグナル伝達カスケードの一部として機能し、浸透圧、酸化および温度ストレスへの適応を促進することが予想される。 したがって、Paracoccidioides と T. marneffei では、DRK1 の転写が浸透圧ストレスに応答して上昇することがわかった。

形態変化の制御は複雑で、DRK1だけにとどまらない。 RYP1-4（酵母相に必要）にコードされる転写因子も相転移を支配し、37℃での病原性に関与する酵母相特異的遺伝子群を制御している。 これらの転写因子は37℃で発現が上昇し、二形性菌と糸状菌の間で保存されている . RYP1 は C. albicans のマスターレギュレーター WOR1 のホモログであり、RYP2 と RYP3 はそれぞれ velvet complex、VosA と VelB の一部である。 RYP4 は、A. nidulans FacB に相同な Zn(II)2Cys6 亜鉛二核クラスター・ドメインタンパク質であるが、酢酸利用には関与していないようである。 これらの転写因子は、CBP1やYPS3などの病原性に重要な遺伝子を含む共通のコア遺伝子に直接結合し、制御する統合的なネットワークを形成している。 RYP1-4の転写を阻害すると、細胞は37℃で適切に相転移が起こらず、菌糸として成長する。

酵母から菌糸という逆方向の形態変化も病原性に重要である。 菌糸として成長することで、環境中での生存、新しい宿主への感染を促進するための分生子の生成、交配による遺伝的多様性が促進される。 B. dermatitidis の SREB と H. capsulatum の SRE1 は GATA 転写因子をコードし、37℃から 22-25℃ への温度低下に伴って菌糸に移行することを制御している。 SREB欠損変異体（SREBΔ）やSRE1-RNAi株は、菌糸への転換を完了できない。 このGATA転写因子の温度適応における役割は、他の菌類にも保存されている。 C. neoformansのSREBとSRE1のホモログであるCIR1は、37℃での耐熱性に必須である 。 B. dermatitidisでは、形態学的スイッチの欠陥は、中性脂質（エルゴステロール、トリアシルグリセロール）および脂質滴の生合成の減少に対応している … 飽和脂肪酸（パルミチン酸、16 : 0、ステアリン酸、18 : 0）を外部から補充すると、形態形成と脂質滴形成の欠損が部分的に修正された。 このことは、中性脂質の代謝が、常温での菌糸への相転移に影響を与える可能性があることを示唆している。 SREB と SRE1 は、シデロフォアの生合成や鉄の取り込みに関わる遺伝子の負のレギュレーターとしても 働くが、この役割は相転移とは無関係であるようである。 H. capsulatumでは、細胞内鉄のホメオスタシスに関与する液胞ATPaseをコードするVMA1を欠失させると、25℃で菌糸に転換しない細胞が見られるようになった。 このことは、SREBによって制御されていない鉄代謝が、温度依存的な形態学的スイッチに影響を与える可能性を示している。 T. marneffeiでは、25℃における菌糸形態への転換と糸状形態の維持は、それぞれHGRAとTUPAにコードされる転写因子によって制御されている . B. dermatitidisとH. capsulatumでは、転写調節因子に加えてN-アセチルグルコサミン（GlcNAc）がNGT1およびNGT2膜貫通輸送体を介して酵母から菌糸への転換を促進する

5. In Vivo Transcriptional Profiling

挿入型突然変異誘発法などの前進的遺伝戦略の使用は、熱二型菌に関連した医療真菌学の分野を実質的に発展させてきた。 その結果、相転移を制御する新規遺伝子や遺伝子ネットワーク（DRK1、RYP1-3、SREBなど）が発見された。 ゲノムワイド関連研究の時代において、二形性真菌の新規遺伝子や遺伝子ネットワークを発見するための未開拓の貯蔵庫は、感染時の酵母の転写プロファイリングである。 病原性に重要な遺伝子を同定するために、Blastomyces dermatitidis 26199株のin vivo転写プロファイリングをマウス肺感染モデルを用いて実施した。 マウス肺組織からB. dermatitidis酵母を効率的に分離し、RNA-Seqのための高品質RNAを得るための新規2ステップ技術を開発した。 温度やその他の条件に依存せずに転写が変化する B. dermatitidis 遺伝子を特定するため、マウス肺から分離した酵母の転写プロファイルを、37℃でマクロファージと共培養した酵母、37℃で骨髄由来マクロファージを用いずに試験管内で培養した酵母、22℃の菌糸と K-means cluster analysis で比較した … この解析により、温度、マクロファージ共培養、培地条件に依存せず、in vivoで>2倍に発現が上昇した72遺伝子が同定された。 これらの遺伝子のサブセットには、細胞外環境に分泌されるタンパク質、金属カチオンの取り込みと輸送、アミノ酸代謝をコードするものが含まれていた。

B. dermatitidis酵母の肺感染時には、亜鉛の獲得に関わる遺伝子がアップレギュレートされていた。 ジンコフォア（PRA1/ZPS1）、高親和性亜鉛トランスポーター（ZRT1）、低親和性亜鉛トランスポーター（ZRT2）である。 Candida albicansでは、PRA1が細胞外に分泌され、細胞表面でZRT1と相互作用して亜鉛を結合し、菌体内へ送り込む。 C. albicans、Aspergillus fumigatus、Ustilago maydisでは、PRA1とZRTは共役でシンテニックを形成している。 ブラストミセスでは、PRA1とZRT1は共役しているように見えるが、これらの遺伝子は共役していない。 意外なことに、PRA1は二型真菌の間ではあまり保存されておらず、H. capsulatum、Paracoccidioides属、Emmonsiaのゲノムには存在しないが、Coccidioidesにはホモログが存在する。 C. albicansでは、PRA1が病原性に影響を与えると推測されている。 PRA1を欠損させた変異体は、亜鉛欠乏条件下で内皮細胞を溶解する能力が低下している。

B. dermatitidisは、生体内の亜鉛消去機構をアップレギュレートすることに加え、ニッケルトランスポーターをコードするNIC1の転写を増加させている。 ニッケルは、尿素をアンモニアと二酸化炭素に変換する酵素であるウレアーゼが正しく機能するために必要です。 尿素は、プリンヌクレオチド異化作用の産物として哺乳類の組織に存在します。 コクシジオイデスでは、ウレアーゼは複製中に球状体から放出され、アンモニアを産生することで組織を損傷し、微小環境をアルカリ性にする . C. posadasii のウレアーゼ遺伝子 (UREΔ) を欠損させると、マウス肺感染モデルにおいて病原性が減弱することがわかった。 肺感染部位において、UREΔ細胞は肺組織中の尿素を異化できず、pHを下げることができない（組織pHはUREΔ7.2に対して野生型はpH7.7）。 さらに、ヌル変異体を感染させたマウスは、UREΔ細胞を包む肉芽腫を形成し、より組織的な免疫反応を示した。 Cryptococcus neoformansでは、NIC1とURE1が脳への浸潤に寄与している。 いずれかの遺伝子を欠損させると、NIC1ΔおよびURE1Δの酵母細胞が中枢神経系に侵入する能力が低下する。 URE1は、Cryptococcus gattiiの病原体にも関与している。Cryptococcus gattiiは、主に肺感染を引き起こすが、動物モデルでは中枢神経系への侵入を好むことが知られている。 C. gattii URE1Δ は、肺感染時の病原性が弱まり、血流への播種能力が低下し、マクロファージ内での細胞内複製が損なわれる。

B. dermatitidis は肺感染時に、アミノ酸の異化に関わるジオキシゲナーゼをアップレギュレートする . この酵素には、4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (4-HPPD, HpdA), homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA), indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), cysteine dioxygenase (CDG) が含まれる。 HpdAとHmgAは二型真菌の間で保存されており、遺伝子クラスターに局在している。 B. dermatitidisではHpdAとHmgAの正確な役割は不明であるが、T. marneffeiの研究により、チロシン異化作用に関わるこれらの遺伝子が病態にどのように影響するかが明らかになった。 HpdAとHmgAの欠損変異体は酸化ストレスに過敏であり、マウスやヒトのマクロファージで酵母に対する胞子発芽が損なわれている。 4-HPPD活性の阻害は、温度依存的な形態変化に重要であると思われる。 T. marneffeiとP. brasiliensisのNTBC (2-(2-nitro-4-trifluoromethylbenzoyl)-cyclohexane-1, 3-dione) による4-HPPDの化学阻害は25℃から37℃への温度上昇に伴う子嚢または菌糸の酵母への変換をブロックした。

トリプトファン分解における真菌IDOの役割はよく分かっていない。しかし、腫瘍細胞は宿主の免疫細胞から逃れるために、微小環境下でトリプトファンを分解するIDOをアップレギュレートしている。 H. capsulatumとP. brasiliensisの肺感染では、宿主のIDOが誘導され、真菌の増殖を抑え、Th17 Tリンパ球の分化を抑制し、過剰な組織炎症を抑える。

B. dermatitidisは肺感染時にシステインジオキシゲナーゼ（CDG）に加え、システイン合成酵素A（CSA）と亜硫酸排出ポンプ（SSU1）もアップレギュレートする . CSAはアセチル-L-セリンからL-システインの生合成に関与する酵素をコードしている。 CDGはL-システインをL-システインスルホン酸に分解し、さらにピルビン酸と亜硫酸塩に異化される。 蓄積された亜硫酸塩は細胞に対して毒性を示す可能性があり、SSU1がコードする排出ポンプを介して分泌される。 C. albicansでは、CDG1およびSSU1を欠損させると、システイン存在下での菌糸成長が阻害され、CDG1Δは欠損するがSSU1Δは欠損せず、マウス感染時の病原性が減弱する。 Arthroderma benhamiaeなどの皮膚糸状菌では、CDO1によるシステインの亜硫酸への分解とSSU1による亜硫酸の細胞外への排出が、ケラチンの分解を促進し菌の増殖を促すと考えられている。 A. benhamiaeのCDO1およびSSU1欠損変異体は、毛髪や爪のようなケラチンを多く含む基質上で生育する能力が損なわれている。 これらのデータから、システインの分解と亜硫酸塩の分泌が、ケラチンが豊富で肺外への播種が最も多い皮膚でのブラストミセス酵母の増殖を促進する可能性がある。 結論

熱性二型真菌は、免疫防御が損なわれた人と損なわれた人に感染することができるユニークな子嚢菌のグループである。 核体温（37℃）に適応して酵母の形態に移行する能力は病原性に必須である。 酵母への形態変化は、宿主組織への接着、マクロファージでの増殖および溶解、適切なサイトカイン応答の鈍化、細胞媒介免疫の障害を促進する特定の病原性因子のアップレギュレーションと関連している。 菌糸と酵母の間の可逆的な移行を制御するためには、これらの菌類が温度、CO2緊張、性ホルモンなどの多くの刺激に適応し、応答することが必要である。 In vivo転写プロファイリングにより、哺乳類宿主での増殖や病原性に重要な、これまで認識されていなかった遺伝子が明らかになり始めている。

利益相反

著者は利益相反がないことを宣言する。