好中球の脱皮。 Paracellular or Transcellular?

炎症の典型的な特徴の1つは、多形核白血球（PMN）による患部組織への浸潤である。 このような炎症が起こるためには、循環しているPMNが内皮との接着相互作用を受け、活性化され、平らになり、微小血管の内皮を横切って移動できるようにする必要がある。 これらの接着相互作用の分子的な決定要因については広く研究されており、PMNが組織内に遊走できる状態になるまでの一連の過程については、一般に合意が得られている(3, 12)。 最初に、循環しているPMNと内皮の間に弱い接着相互作用が起こり、内皮に沿ったPMNの塩性移動が起こるが、これはローリングと呼ばれる現象である。 ローリングによって、PMNは内皮に密着した状態を保つことができ、局所的に生成された炎症性メディエーターが存在する場合、PMNは活性化される。 一旦活性化されると、PMNは内皮とより強い接着相互作用を形成し、その結果、PMNは停止する。 その後、PMNは内皮を横切って移動する。 最初の接着相互作用（ローリングと接着）については、そのメカニズムについて一般的なコンセンサスが得られているが、PMNの内皮横断移動に関与するメカニズムについてはほとんど分かっていない。 PMNが内皮細胞の間を移動するのか(paracellular pathway)、それとも内皮細胞を通過するのか(transcellular pathway)という大前提でさえ、論争がある。

一般的なコンセンサスでは、循環するPMNは隣接する内皮細胞の間を通って血管内区画から間質へ、すなわち、paracellular pathwayを使って移動するとしている (11). 電子顕微鏡や光学顕微鏡を用いたin vivoおよびin vitroの研究では、化学走性勾配に反応して内皮細胞間を仮足を伸ばして内皮バリアを通過する移動性PMNの姿が捉えられている。 PMNが内皮を通過するためにパラセルラー経路を利用するためには、隣接する内皮細胞間の接着結合が破壊され、内皮細胞がPMNの通過を可能にするほど互いに離間していなければならない。 in vitroで炎症をシミュレートするために用いられる多くの炎症性メディエーターは、それ自体、培養内皮細胞単層に隙間の形成、すなわち内皮細胞の後退を誘発することが可能である。 しかし、in vivoの炎症モデルでは内皮細胞間に大きな隙間が生じることはほとんどないため、この現象はin vitro系での炎症メディエーターの効果が誇張されたものである可能性があります。 培養内皮単層膜は生体内と比較して内皮細胞間接着結合が未発達であるため、炎症性メディエーターは生体内よりも生体外で内皮細胞の後退を容易に生じさせる可能性があります(12)。 この現象に対応するものとして、in vivoでは、炎症性メディエーターに反応して観察される血管内皮間接合部からの高分子の漏出が増加することがあげられる。 PMNが内皮細胞の後退を引き起こすという証拠は、主にPMNを介した内皮細胞傷害に関与するメカニズムを扱ったin vitroの研究から得られたものである(12)。 この傷害は本質的に非溶解性であり、非多孔性表面上で成長した単層からの内皮細胞剥離として現れた。 この内皮細胞の剥離は、内皮細胞単層表面に活性化PMNを重ねた3-6時間後に起こり、PMN由来のエラスターゼに起因するとされてきた。 内皮細胞の剥離はin vivoの炎症モデルではほとんど観察されないので、PMNによる内皮細胞の剥離もin vitroで課された実験条件によるin vivoの事象の誇張であるように思われる。 これらの系（非多孔性表面上で成長した内皮単層）では、PMNは内皮細胞単層から移動することが許されない。 そのため、PMNは内皮細胞の近くに留まり、単層をタンパク質分解的に悪化させ、最終的には内皮細胞の後退とそれに続く剥離を誘発する。 活性化したPMNを内皮細胞単層に移動させた場合、内皮細胞の総収縮と剥離はほとんど観察されない。

PMN由来のエラスターゼは単層内の内皮細胞の収縮と剥離を誘発することができる。 これは、内皮細胞の増殖にプロテアーゼを使用した場合と類似している。すなわち、プロテアーゼ処理された細胞は基質から後退し剥離するが、プロテアーゼ阻害剤で処理すると、再播種して正常に増殖し続けることができるのである。 興味深いことに、内皮細胞の後退もPMNの内皮横断移動も、プロテアーゼ（エラスターゼなど）阻害剤によって阻止できるのである。 これらのことは、PMNが内因性のエラスターゼを用いて、隣接する内皮細胞間を傷つけずに通過できる程度の内皮細胞の収縮を誘導していることを示している。 最近の研究から、エラスターゼを介したPMNの内皮細胞移動は高度に制御されたプロセスであり、PMNの脱顆粒を必要としないことが示唆されている(3)。 活性化されたPMNはエラスターゼを細胞外に分泌するのではなく、エラスターゼを膜に動員し、移動する前線、例えば隣接する内皮細胞の間に侵入する仮足に局在させる。 PMNの脱顆粒が内皮を通過するのに必要でないことは、PMNの細胞質（顆粒をもたない無核PMN）が通常のPMNと同様に化学的勾配に応答して内皮単層を移動するという観察によってさらに支持される。 この場合も、エラスターゼ阻害剤によって細胞質の内皮横断移動は阻止される。

内皮細胞は、膜貫通タンパク質からなる接着接合によって結合されている（11）。 したがって、好中球が内皮細胞間を通過するためには、これらの接合部の接着相互作用が破壊されなければならない。 PMNが内皮を通過するのに関連する接着結合は2つある：アドヘレンズ結合とタイトジャンクションである。 アドヘレン結合は血管内皮（VE）-カドヘリン／カテニン複合体から構成されている。 VE-カドヘリンは細胞外ドメインを持っており、隣接する内皮細胞上のVE-カドヘリンとホモタイプに相互作用している。 VE-カドヘリンの細胞質ドメインは、細胞内のβ-あるいはγ-カテニンと会合している。 これらのVE-カドヘリン／カテニン複合体は、α-カテニンを介してアクチン細胞骨格に結合している（Fig.1A）。 タイトジャンクションは、オクルディン、クローディン1、2などの複数の膜貫通タンパク質と、タイトジャンクションタンパク質を細胞骨格につなぐZO-1、-2、-3などの細胞内タンパク質で構成されている。 これら二つの接着結合のうち、PMNの内皮移行がアドヘレンスジャンクションに及ぼす影響が最も注目されている

共焦点顕微鏡を用いた最近の研究は、PMN接着相互作用（接着及び内皮横断移動）が、アドヘレンス接合タンパク質の局所破壊をもたらす可能性があることを示している（10）。 内皮細胞単層に接着している2つのPMN集団が捕らえられた：1）その下にアドヘレンス接合タンパク質の連続性の破壊がないもの、2）その下にアドヘレンス接合タンパク質の破壊があるものである。 付着したPMNによるアドヘレンス接合部の連続性の破壊は局所的な現象であり、PMNから離れたアドヘレンス接合部は影響を受けなかった。 すなわち、β-カテニンがVE-カドヘリンより先に消失していた。 内皮を通過して移動する過程で捕捉されたPMNは、必ずその移動部位ですべてのアドヘレンスジャンクションタンパク質の喪失を伴っていた。 この場合も、移動しているPMNからさらに離れた部位では、アドヘレンスジャンクションの完全性に影響はなかった。 さらに、PMNの経内皮移動におけるアドヘレンズジャンクションの破壊の重要性を示す証拠としては、以下のものがある。 1) in vivoでは、VE-cadherinに対する抗体がPMNの移動を増加させた。2) in vitroでは、VE-cadherinに対する抗体がPMNの血管内皮移動の増加、内皮アクチン細胞骨格の再編成の誘発、結果として内皮細胞間に隙間ができた。

tight junction complexに関して、最近の研究は同様の観察をしている。 PMNの内皮横断移動は、内皮間接合部にPMNが侵入した部位でのみZO-1と-2の連続性を破壊した(1)。

Potential mechanisms involved in paracellular diapedesis

PMN-endothelial cell adhesive interactionsがadherens junctionを破壊するメカニズムは不明であった。 一つの可能性は、接着したPMNが内因性プロテアーゼを使ってアドヘレンズジャンクション蛋白質を分解することである（Fig.1A）。 例えば、エラスターゼ阻害剤は、PMNによって誘発されるアドヘレン結合タンパク質であるVE-カドヘリンとβ-カテニンの消失の程度を減少させることができた(2)。 他の研究（11）では、活性化したPMNはVE-cadherinを分解することができ、エラスターゼ阻害剤はこの分解を防ぐことができるとされている。 さらに、精製した好中球エラスターゼは、活性化PMNによるこのアドヘレンスジャンクション成分の分解後に見られるのと同様のVE-カドヘリンの分解産物を生成することが示された。

PMN-内皮細胞接着性相互作用はまた、内皮細胞が互いに分離することによってPMNの内皮移動に積極的に参加するようなシグナル、すなわち内皮間隙形成（図1A）を送る可能性がある。 この主張は、次のような証拠によって裏付けられている。 付着したPMNは内皮細胞のCa2+レベルの上昇を誘発し、このCa2+をキレートすることでPMNの内皮間移動が抑制される。 さらに、内皮ミオシン軽鎖キナーゼ（内皮細胞間隙形成の重要な決定因子）の阻害は、PMNの経内皮移動を減少させた(11)。 最後に、上記で指摘したように、接着したPMNは、細胞膜に広がるVE-カドヘリンよりも先に、細胞内のβ-カテニンに影響を与える。 3756>

Evidence in favor of transcellular diapedesis

Many early and more recent reports that examined leukocyte diapedesis in vivo using a ultrastructural approach has that majority of PMNs exit the vasculature transcellular, i.e…… (超音波による生体内白血球移動の研究) 内皮細胞質を横切る孔または通路を通してである。 透過型電子顕微鏡による連続切片の検討は、PMNが識別可能な細胞間結合を持たない領域を通って移動できることを示唆している(4, 5, 8)。 連続切片でさえ、細胞間結合が近くになかったことを明確に証明するものではなく、むしろ見逃している可能性があると論じられてきた。 さらに、特に内皮の高さが<0.5μmである領域では、電子密度の高いアドヘレンスジャンクションを識別することが困難である場合がある。 最後に、最近のin vitroのデータでは、細胞-細胞間のアドヘレン結合はPMNsの脱出中に分子的に分解されるため（10）、形態的に見ることは期待できない。

走査型電子顕微鏡の画像は、PMNsが内皮細胞-細胞接触とは関係のない開口部から内皮細胞に侵入している、より有力な証拠を示している（4、9）。 脱皮の過程にあるPMNは、内皮の高さの領域で狭窄を伴うダンベル型をしているように見える(4, 5, 7, 8, 9, 13, 15)。 ダイアペディシスがどの程度進行しているかによって、血管内腔に突出するか、間質に伸展する泡状の伸展が見られる（5, 9, 11, 15）。 このことは、白血球が個々の内皮細胞同士の引き込みを誘発するのではなく、小さな限られた直径の円形の孔から絞り出されていることを示している。 内皮細胞と白血球はテープデシスの間中、密接に接触したままである。 内皮細胞はしばしばPMN表面の内腔側に沿って広がり、PMNを完全に飲み込み、それによってPMNが組織マトリックスに放出される前に内腔の隙間を塞いでいるように見える(4, 5, 8)。

Potential mechanisms involved in transcellular diapedesis

in vivoの研究で厳格なメカニズムアプローチを適用することは難しいが、PMNが細胞外遊走するいくつかの可能なメカニズムを支持する十分な状況証拠が存在する。 PMNが移動するための細胞間隙は内皮のタンパク質分解の結果である可能性がある。 しかし、少なくとも超微細構造的には、内皮は損傷を受けず、PMNと密着している膜領域でもカベオレやエンドサイトーシス小胞を形成し続けていることが指摘されている(13)。 PMNは頂膜内皮表面に沿って短距離移動するようであるが、内皮の薄い領域、例えばフェネストレを探し出す可能性が高い。 フェネストレは開口しているか（直径50nm）、2枚の細胞膜の厚さの隔膜で覆われている（細胞質はない）ことがある。 したがって、PMNは内皮を傷つけることなく、開いたフェネストレを容易に通り抜けることができ、また横隔膜を持ったフェネストレをタンパク質分解的に通過することができる。 フェネストレは、柵状微小血管を含む器官（例えば、胃腸粘膜、分泌腺）において、PMNの移動のための重要な経路を示すと思われる。

連続した微小血管を含む臓器（例えば皮膚、筋肉）では、PMNはカベオラまたはピノサイトーシス小胞を利用し、そこに糸状体を挿入して内皮バリアを貫通させることができる。 直径50から100nmのこれらの構造は、内皮を介したタンパク質輸送を仲介し、炎症時の血管タンパク質漏出のための機能外経路を提供すると考えられている。 最近、カベオラは、内皮細胞の細胞質を横断する小さな連続した膜結合通路を形成することができるvesiculo-vacuolar organellesを形成することが示されている(6)。 このようなカベオレと小胞の形成は、付着したPMNと接触している内皮表面膜領域で継続することが証明されている(13)。 また、内皮細胞表面に密着したPMNは、しばしば指状の糸状体を先端形質膜のくぼみに伸ばし、それによって内皮表面を再形成する（4, 7, 8）。 付着した糸状体が形成する小胞体への突出力によって、この糸状体が内皮外膜側に出現し（図1B）、そこで細胞外マトリックスと容易に相互作用し、それに沿って広がっていくのであろう（図1B）。

PMNの先導仮足におけるF-アクチンおよびマイクロフィラメントの濃度は、in vivo (15) およびin vitro (3) のダイアペディシス中に証明されており、細胞横断孔を通して前進する細胞過程を引き寄せるために必要な力を発生させると考えられている。 孔は3-5μmの大きさまで広がり、白血球が容易に通過できる。 この最初の液胞孔の拡大は、血管の内腔にまだ突出している白血球の球状部分に存在する皮質マイクロフィラメントシステムの張力によって生じる力によって部分的に達成されると思われる。 実際、移動するPMNの尾部にはF-アクチンが集中していることが、脱血の後期には観察されている(15)。 さらに、内皮細胞質における細胞骨格の再配列は、以前に示唆されたように、経内皮孔の拡がりを助ける可能性がある(14)。 孔の形成過程は、電子顕微鏡写真で証明されているように、PMN細胞表面に沿って頂膜内皮領域が広がり、最終的に内皮による内腔PMN部分の巻き込みにつながるだろう（Fig 1B）。 内皮のこの積極的な参加は、内皮の内膜の迅速な再封鎖を助け、それによってタンパク質の漏出を制限することになるでしょう。

Summary

この証拠のレビューから、PMNs は炎症中に内皮バリアを通過するために、傍細胞および細胞横断的な経路を使用できることが明らかである。 しかし、in vitroでのPMNの内皮移行は傍細胞性経路を好むのに対し、in vivoでのPMNの内皮移行は経細胞性経路を好むことは指摘しておく価値がある。

培養で成長した内皮細胞単層では、最も減衰した領域は細胞間の接合部付近であり、したがって、この部位がダイアペディシスが起こる場所として好まれることは驚くには当たらない。 さらに、培養内皮細胞では、細胞間結合は常に分解と再構築が繰り返されている不安定な構造である。 このような領域には、移動する白血球の仮足が容易にアクセスできるだろう。 また、in vitroでも、PMNが脱血する際に使用する傍細胞経路は特異的に選択されている、すなわち、脱血は2つの内皮細胞の間ではなく、三叉路の角で優先的に起こるという証拠がある(1)。 アドヘレンズジャンクションやタイトジャンクションはこの三叉路で不連続となるため、移動するPMNにとって最も抵抗の少ない道となる。 一方、内皮細胞間の結合はin vivoではよりよく発達しており、それを横切るタンパク質の移動に対してより耐性がある。

この現象を研究するためにin vitroとin vivoのどちらのアプローチが使われたかで、テープレースの際にPMNが使う優先経路（傍細胞性対細胞性）を決めるのは、特に、単純化しすぎである。 このパラダイムから逸脱した例も数多くある。 例えば、PMNはin vivoでは傍細胞性経路を、in vitroでは超細胞性経路を使うことができるという証拠がある。 さらに、もし生体内のPMNの脱出が細胞外経路を優先しているのであれば、なぜ接合タンパク質を阻害すると生体内のPMNの脱出が劇的に変化するのだろうか？ この議論は、血管内皮を通過するタンパク質の移動が、傍細胞経路と細胞外経路のどちらを優先して起こるかという議論と同様に、今後何年も続く可能性がある。 PMNの経内皮移動の経路に関する議論は、部分的には、炎症反応の性質やそれが起こる血管床の性質に起因しているのかもしれない、と想像することができる。 さらなる研究により、この論争を解決するための追加情報が得られることを期待する。

.