古典的ヒストン脱アセチル化酵素とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の概要

要旨

遺伝子発現、細胞増殖、生存を制御するヒストン脱アセチル化酵素の重要性は、抗がん剤としてヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を開発する上で、魅力あるターゲットになっています。 プロトタイプのトリコスタチンAの構造類似体であるスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ボリノスタット、ゾリンザ）は、2006年に米国食品医薬品局から進行性皮膚T細胞リンパ腫の治療薬として承認されました。 その後、2009年に環状ペプチドであるデプシペプチド（ロミデプシン、イストダックス）が同疾患の治療薬として承認されました。 現在、数多くのヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、血液がんおよび固形がんの治療を目的として、前臨床試験および臨床試験が行われています。 これらの研究の多くは、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と他の治療法、特に従来の化学療法や放射線療法との併用に焦点を当てたものである。 本稿の目的は、古典的なヒストン脱アセチル化酵素とヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の概要、および併用療法の可能性に重点を置くことである

1. はじめに

クロマチンは、DNAメチル化や翻訳後ヒストン修飾などの多くのメカニズムを介して、転写、複製、修復などの代謝プロセスを促進するためにリモデリングを受ける動的な構造である。 翻訳後ヒストン修飾の中でも、1960年代に初めて定義されたアセチル化は、よく研究されている修飾の1つである。 ヒストンのアセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）とヒストンデアセチラーゼ（HDAC）という2つの酵素グループの相反する作用によって制御されている。 HATは、ヒストンのリジン残基のε-アミノ基に基質であるアセチル-CoAのアセチル基を転移させる触媒作用を持っています。 これにより、ヒストンの正電荷が中和され、負電荷を持つDNAとの相互作用が弱まる。 その結果、クロマチンの構造がより緩和され、転写が許容されるようになる。 HDAC酵素はヒストンからアセチル基を除去し、より凝縮された、転写抑制的なクロマチン状態にする。 クラスIII HDAC酵素は、サーチュイン1-7を含み、リジン残基を脱アセチル化するためにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）を必要とするものである。 これらは、多くの疾患や老化のプロセスに関与しているとされている。 残りの11種類の酵素は典型的なHDAC酵素として知られており、本論文の残りの部分で焦点を当てることにする。 1990年代に最初のヒトHDACがクローニングされ、その特徴が明らかにされた後、これらの酵素の機能と薬理学的操作に対する強い関心が急速に高まった。 古典的なHDAC酵素のさまざまなアイソフォームは、広範な系統学的解析を経て、3つのクラスに分類されている（図1）。 クラス1は、酵母の転写調節因子RDP3と類似性を持つHDAC1、2、3、8からなる酵素で、主に核に局在している。 これらの酵素はユビキタスに発現しており、細胞の増殖や生存を制御する重要な機能的役割を担っている。 一方、クラスII HDAC酵素は、酵母のHda1と相同性を持ち、細胞質と核の間を行き来し、組織特異的な発現パターンと制御機能を有している。 クラスII酵素は、さらにクラスIIa（HDAC4、5、7、9；核と細胞質を行き来する）とクラスIIb（HDAC6、10；主に細胞質）に細分化される。 HDAC酵素の異なるアイソフォームの機能については、最近レビューされている。 特に興味深いのはHDAC6である。HDAC6は主要な細胞質性脱アセチル化酵素で、少なくとも部分的には、特異的阻害剤であるツバシンを用いた研究により、比較的よく知られるようになった … HDAC6は、α-チューブリン、コータクチン、その他のシャペロン、ペルオキシレドキシンなど、多くの非ヒストンタンパク質が標的であることが同定されている。 HDAC6は、細胞の増殖と生存に重要な役割を果たすことから、癌治療の重要なターゲットとされている。 最近の知見では、HDAC6阻害剤であるtubacinと従来の化学療法剤との併用により、正常細胞ではなく、がん細胞に対して細胞毒性およびアポトーシス効果を示すことが示されている . さらに、HDAC6は中枢神経系損傷後の保護と再生に重要な標的であることが示されている 。 HDAC11は、クラスIとクラスIIの両方の酵素と類似性を持つ、クラスIVの唯一のメンバーである。 HDAC11が免疫調節の役割を担っていることは、最近の研究で明らかになっている.

2.Histone Deacetylase Inhibitors

HDAC阻害活性を有する化合物のいくつかの異なる構造群が知られているより引用した。 最も広く研究されているHDAC阻害剤は、ヒドロキサム酸の原型であるトリコスタチンAです。 トリコスタチンAは、Streptomyces hygroscopicusの代謝物から単離された強力な抗真菌性抗生物質である。 この化合物は、クラスI、II、IVのすべての酵素に対して比較的高い親和性を示す無細胞アッセイで、強力で幅広いスペクトルのHDAC阻害剤である。 ヒドロキサムのもう一つの例は、臨床的に利用可能なスベロイルアニリドヒドロキサム酸 (SAHA, Vorinostat, Zolinza) である。 SAHAは、トリコスタチンAと同様に、強力で幅広いスペクトルのHDAC阻害剤である。 SAHAは、その強力な抗がん作用と良好な治療域から、2006年に米国食品医薬品局（FDA）より進行性皮膚T細胞リンパ腫（CTCL）の治療薬として承認された。 現在、臨床試験中の他のヒドロキサム酸には、belinostat（PXD101）、panobinostat（LBH589）、givinostat（ITF-2357）などがあります。 このクラスの化合物は、ナノモルから低ミクロモル領域でHDAC阻害活性を有している。 また、デプシペプチド（ロミデプシン、イストダックス）は、2009年にCTCLの治療薬としてFDAから承認されている。 同様に、エンチノスタット（MS-275、SNDX 275）やMGCD0103などのベンズアミド系も、低マイクロモル域の活性を持つ強力なHDAC阻害剤である。 HDAC阻害剤の中で最も効力が弱いのは脂肪族酸類であり、ミリモル単位の活性を持つ。 このグループには、抗てんかん薬として臨床で広く使用されているバルプロ酸が含まれる。 私たちは、脂肪族酸のもう一つの例である酪酸ナトリウムを用いて、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の抗がん作用を強調しました（図2）。

HDAC阻害剤は高アセチル化ヒストンの蓄積をもたらし、悪性細胞株の約2〜20％の遺伝子発現を変更することが示されてきた 。 全体として、HDAC阻害剤は細胞増殖を減少させ、細胞死、アポトーシス、分化を誘導し、細胞周期停止（低濃度ではG1、比較的高濃度ではG1およびG2/Mの両方）を引き起こし、悪性および形質転換細胞株の移動、侵入、血管形成を減少させることが示されてきた ……。 HDAC阻害剤の効果は、正常細胞では少なくとも10分の1程度であり、癌におけるHDAC阻害剤の臨床的有用性の基盤となる。 HDAC阻害剤の癌治療における治療効果を向上させるために、クラス選択的あるいはアイソフォーム特異的な化合物が提案されている。 この文脈では、HDAC6とHDA8をそれぞれ選択的に阻害するイソフォーム特異的なtubacinとPC-34051がその例である。 この2つの化合物は、最近、抗がん作用を有することが示されている 。 しかし、選択性の問題については、悪性細胞の不均一性や適応性を考慮すると、一般的に忍容性の高い広域のHDAC阻害剤の多面的作用が癌治療に有利であることを示唆する議論もあり、依然として論争が続いている。 しかし、選択的な化合物は、心肥大、喘息、および様々な神経変性疾患の治療を含む可能性のあるHDAC阻害剤の非腫瘍学的応用において、より有益である可能性が高いと一般に受け入れられています。 ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤との組み合わせ治療

HDAC阻害剤は固有の抗癌作用を有するものの、他の癌治療法と組み合わせて使用する際に最も効果的になることが広く受け入れられています。 現在、前臨床および臨床評価が行われている組み合わせは多数ある。 例えば、アザシチジンなどのメチル基転移酵素阻害剤、レチノイン酸などの受容体介在型細胞毒性薬、光線療法などとの併用が挙げられる。 ここでは、HDAC阻害剤の利点と潜在的な複雑さを強調するために、従来のアントラサイクリン系化学療法剤および放射線療法との併用に焦点を当てることにする（図3）。

(a)

(b)

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(b)

アントラサイクリン系は、ダウノマイシンとその構造アナログであるドキソルビシンに代表され、50年以上の臨床歴史を持つ第一線の癌化学療法剤である。 これらは、DNAインターカレーターおよびトポイソメラーゼII酵素阻害剤としてよく知られている。 アントラサイクリン系の作用機序は、RNA合成の阻害、活性酸素の生成、そして特に致死的なDNA二本鎖切断を含むDNA損傷の蓄積を含んでいる。 多くの研究が、HDAC阻害剤がアントラサイクリン系薬剤の細胞毒性作用を増強することを示している。 例えば、トリコスタチンAは、ヒト赤白血病K562細胞、未分化甲状腺癌、A549肺胞腺癌細胞において、ドキソルビシン誘発アポトーシスと細胞死を増強することが示されている. 同様に、SAHAとバルプロ酸は、ドキソルビシンの効果に対する悪性細胞の感受性を高めることが示されている . HDAC阻害剤はヒストンの過アセチル化を誘導し、その結果、転写を許容するクロマチンコンフォメーションがよりオープンになる。この現象はMNase消化アッセイで確認されている . さらに、HDAC阻害剤はアセチル化クロマチンのアントラサイクリンとの結合部位を増加させ、その親和性を高めることが示されている . したがって、HDAC阻害剤は、クロマチン構造を変化させることによって、少なくとも部分的にはアントラサイクリン誘発性の細胞死を増強すると推測される。 しかし、アイソフォーム選択的阻害剤を用いた研究で明らかになったように、HDAC阻害剤を介した遺伝子発現の変化や非ヒストン基質の機能の変化も関係している。

加算的および／または相乗的細胞毒性効果は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤とアントラサイクリンを併用した臨床試験の根拠となっている。 しかし、潜在的な合併症が確認されている。 例えば、デプシペプチドは白血病細胞のMDR1遺伝子をアップレギュレートし、ドキソルビシンに対する耐性をもたらすことが明らかにされている。 MDR1にコードされるP糖タンパク質ポンプの発現は、癌の臨床上の大きな問題である多剤耐性につながることがよく知られており、様々なHDAC阻害剤によって悪性細胞のMDR1遺伝子の抑制を逆転させる可能性が、さらなる研究によって指摘されている . 一方、より最近の研究では、HDAC阻害剤がABCトランスポーターの発現を抑制する可能性が指摘されており、この問題についてはさらなる解明が必要であることが強調されている

HDAC 阻害剤の使用で起こりうるもう一つの合併症として心毒性が挙げられる。 広範なHDAC阻害剤は、それ自体が心毒性を有する可能性があることが研究により示されている。 さらに、HDAC阻害剤で前処理することで、細胞培養系におけるドキソルビシンのDNA損傷および細胞毒性作用が増強されることが示されている。 アントラサイクリン系の副作用として、有害なヒドロキシルラジカルや過酸化水素を含む活性酸素の生成による不可逆的な心毒性が知られている。 心筋細胞は、他の細胞種に比べてスーパーオキシドアニオンや過酸化水素の解毒酵素が比較的少ないことから、特に影響を受けやすい。 肥大反応とDNA二本鎖切断の誘発をエンドポイントとした研究では、幅広いスペクトルのHDAC阻害剤であるトリコスタチンA、バルプロ酸、酪酸ナトリウムがドキソルビシンの効果を増強することが示された … 同様に、in vivoの研究では、心臓におけるHDAC阻害剤の生物学的性質に関する論争が浮き彫りになっている。 例えば、最近の知見では、トリコスタチンAとバルプロ酸はin vivoで負荷やアゴニストによる心肥大から保護することが示されている。 しかし、対照的な知見として、トリコスタチンAはラットの肺動脈バンディングによって引き起こされる右心室機能不全を悪化させることが示されている。 このような合併症の可能性を考慮すると、より選択的あるいはアイソフォーム特異的なHDAC阻害剤と従来の治療薬とのコンビネーター効果が、治療の優位性をもたらすと思われる。 このような背景から、最近の研究では、HDAC6選択的化合物であるtubacinが、形質転換細胞株におけるドキソルビシンおよびエトポシドの効果を増強することが確認されました 。 この方向での更なる評価が期待される。

4. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤と放射線治療の併用

初期の研究では、短鎖脂肪酸の酪酸ナトリウムが電離放射線の細胞毒性に対して結腸および鼻咽頭癌細胞を増強することが示された。 また、HDAC阻害剤の代表格であるトリコスタチンAも悪性腫瘍の放射線感受性を高めることが示された。 さらに、トリコスタチンA、SAHA、デプシペプチド、酪酸ナトリウム、フェニルブチレート、トリブチリン、バルプロ酸など、事実上すべての広域HDAC阻害剤が、悪性細胞の放射線誘発細胞死を増強することが示され、これらの研究結果は支持された . 比較的高濃度のHDAC阻害剤では、線量修飾係数（HDAC阻害剤処理細胞と非処理細胞で同程度の生存率を得るための放射線量の比率）が〜2であることが観察された。 このような高濃度では、HDAC阻害剤による細胞周期停止（G1およびG2）、DNA合成阻害、アポトーシス誘導が放射線感受性の要因であると推測されている。 また、HDAC阻害剤の濃度が比較的低い場合にも、放射線感受性の増強効果が認められる。 HDAC阻害とDNA損傷に応答するシグナルカスケードに関与するタンパク質との関連は、多くの研究によって確立されている 。 以上のことから、HDAC阻害剤の放射線増感作用には、以下のようなメカニズムが関与している可能性がある。 まず、ヒストンの高アセチル化はクロマチン構造を変化させ、よりオープンなクロマチンの確認をもたらし、放射線誘発の初期DNA損傷に対してより感受性が高くなる可能性がある。 さらに、HDAC阻害剤は、DNA損傷応答経路に関与する重要なシグナル伝達タンパク質と相互作用する可能性がある。 最後に、HDAC阻害剤は、DNA二本鎖切断修復経路に関与する遺伝子の転写を制御することが示されている。 例えば、SAHAで前処理すると、放射線誘発のDNA修復タンパク質であるRad51とDNA-PKcsの増加が抑制されることが示されている。 同様に、酪酸ナトリウムは、メラノーマ細胞株におけるDNA修復タンパク質Ku70、Ku86、およびDNA-PKcsの発現を減少させることが示されている 。 さらに、ブレオマイシン、ドキソルビシン、エトポシドを用いてDNA二本鎖切断を誘導し、γH2AX巣の蓄積で評価すると、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤がKu70のアセチル化を標的とし、感作することが示された。

放射線療法との併用では、てんかんの治療で長い臨床歴を持つバルプロ酸は重要である . 前臨床研究では、このHDAC阻害剤はin vitroとin vivoの両方で電離放射線（X線）の影響に対してヒトグリオーマ細胞株を感作することが示されている。 最近、バルプロ酸はアルキル化剤であるテモゾロミドや放射線と併用され、多形性神経膠芽腫の治療薬となりうることが報告されています。 この戦略は現在、第II相臨床試験で評価中である

5. ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の放射線防護効果

逆説的だが、HDAC阻害剤が放射線防護活性を有することを示す証拠が現れつつある。 初期の研究では、フェニルブチレートで前処理することで、ヒトの正常細胞および癌細胞に適度な放射線防護効果があることが示された。 さらに、フェニルブチレートは生体内で皮膚放射線症候群から保護することが示された。 HDAC阻害剤の放射線防護特性は、炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキン（IL-）1、IL-8、腫瘍壊死因子（TNF-）α）や線維性成長因子（例えば、トランスフォーミング成長因子（TGF-）β）の抑制が関係していると考えられている ……。 これらは放射線に対する炎症反応に関与することが知られており、特に、上皮、内皮および結合組織細胞からのTNF-αおよびTGF-βの長期分泌は、皮膚放射線症候群に関与していると考えられている。 フェニルブチレートに加えて、幅広いスペクトルのHDAC阻害剤であるトリコスタチンAとバルプロ酸が、マウスにおける放射線誘発皮膚傷害と放射線誘発致死から保護することが示されている。 これらの効果は、TNF-α、TGF-β1、およびTGF-β2の発現の減少とも相関していた。 フェニルブチレートを用いたこの方向でのさらなる研究により、このHDAC阻害剤が急性γ線誘発致死からマウスを保護することが示された。 この効果は、DNA損傷とアポトーシスの減衰と相関していた。 興味深いことに、フェニルブチレートの予防的投与と放射線照射後の投与は放射線防護をもたらし、興味深い臨床応用の可能性を示している。 また、不注意による放射線被曝の場合は、放射線照射後の投与が適切であろう。 結論

HDAC 阻害剤は、抗がん剤の新しい重要なクラスとして出現した。 それらは単独で強力な細胞毒性およびアポトーシス効果を有するが、他のがん治療法と組み合わせて使用する場合に最も有用であることが予想される。 このことは、現在行われている臨床試験の多くが、HDAC阻害剤と従来の化学療法や放射線療法との併用療法であることからもうかがい知ることができます。 この分野では、クラス選択的あるいはアイソフォーム特異的な化合物が、従来の幅広いスペクトルを持つHDAC阻害剤よりも高い治療効果を持つかどうかという重要な疑問が残されている。 ブロードスペクトラムHDAC阻害剤は多面的な抗がん作用を有し、悪性細胞の不均一性や適応性を考慮すると、これは有利な点であると考えられます。 一方、クラスあるいはアイソフォーム選択的な化合物は、オフターゲット効果を低減させ、より大きな治療域を提供する可能性がある。 現在、HDAC酵素の機能をさらに理解することを目的とした研究が活発に行われており、より特異的な化合物の利用が可能になってきている。 したがって、選択性の問題が解明され、このクラスの化合物の臨床応用の機会がさらに広がることが期待されます。 カラギアニスは、この論文で言及された商業的なアイデンティティと、利害の対立につながるような直接的な金銭的関係がないことを宣言しています。

謝辞

オーストラリア原子力科学・工学研究所の支援に感謝します。 T. C. KaragiannisはAINSE賞の受賞者である。 エピゲノム医学研究所はオーストラリア国立保健医学研究評議会の支援を受けている。 K. VerverisはBaker IDI大学院奨学金による支援を受けている。 本論文は、ビクトリア州政府の運用基盤支援プログラムにより一部支援されています。 AMREPのMonash Micro Imagingが提供する施設の利用、特にStephen Cody博士とIśka Carmichael博士の専門的な支援に感謝したい

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