フィブリンや血漿の凝固に影響を与えないヘパリン解毒剤

背景と目的

抗凝固剤は血栓塞栓症の治療において極めて重要な役割を担っています。 抗凝固剤投与中の外科患者における出血は大きな懸念事項である。 抗凝固剤に対抗し，正常な止血を回復するために解毒剤の投与が行われる。 現在までに、未分画ヘパリンの解毒剤として臨床的に承認されているのは、カチオン性ポリペプチドの硫酸プロタミン（PS）だけです。 PSには毒性のある副作用と限界があります。 PSが低分子ヘパリンやフォンダパリヌクスを完全に解毒できないのは、これらの薬剤に対する結合親和性が低いためである。 しかし、PSはフィブリノゲンなどの凝固タンパク質と相互作用して凝集体を形成し、心血管系の副作用を引き起こす。 最近、我々はヘパリン類に高い結合親和性を有する合成万能ヘパリン逆転剤（UHRA）を開発した。 UHRAは、臨床で使用されているすべての非経口抗凝固薬の活性を完全に逆転させ、無毒であることがin vivo試験で明らかになった。 本研究では、UHRAがフィブリノーゲン、フィブリン凝固構造、血漿凝固および凝固塊溶解に及ぼす影響を評価することにより、UHRAの無毒性を実証することを目的としています。

Methods

UHRAは、樹枝状高分岐ポリグリセリンの足場に3級アミン系のヘパリン結合基を組み込み、メトキシポリエチレングリコール鎖でキャップして開発したものです。 UHRAの凝固系への影響を理解するために、再石灰化および組織因子（TF）誘発の比濁血漿凝固アッセイを実施した。 UHRAのフィブリノーゲンへの作用は，フィブリノーゲン凝集測定，フィブリン重合測定および分光分析（蛍光および円二色性（CD））により検討した。 UHRAによる抗凝固剤（ヘパリン）の中和作用をヒト血小板豊富血漿（PRP）中の蛍光トロンビン生成アッセイ（TGA）により検討した． 外因性組織プラスミノーゲンアクチベーター（t-PA）に曝露したUHRAまたはPSを含むTF誘導血漿塊の溶解を、濁度測定法により調べた。

結果および考察

血漿凝固アッセイの結果から、UHRAはPSと比較して凝固パラメータに変化を及ぼさなかった（TF開始ラグタイムおよび最大吸光度、コントロール vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.1, p=0.1）。21および0.16、再カルシウム化におけるラグタイムおよび最大吸光度、コントロール対UHRA 200mcg/mL、それぞれp=0.08および0.13）このことはUHRAが調査した濃度では凝固系に影響を及ぼさないことを示唆している（図1）。 プロタミンと異なり、フィブリノーゲン凝集およびフィブリン重合アッセイは、0.05mg/mLから1mg/mLまでの広い濃度範囲でUHRAの影響を受けなかった。 トリプトファン蛍光消光測定（図2）およびフィブリノーゲン二次構造測定と合わせて、UHRAがフィブリノーゲンと相互作用しないことを裏付けている。 この結果は、フィブリノーゲンと相互作用して凝集や構造変化を引き起こすPSや他の合成カチオンポリマーとは全く異なるものである。 UHRA存在下（0.5 mg/mLでも）で生成したフィブリン塊は、正常なフィブリン塊と同様の構造と繊維径を示した（コントロール vs UHRA 0.5 mg/mL clot, p=0.12）（図3）。 一方、0.05mg/mL PS（臨床用量）存在下で形成されたフィブリン凝塊は、繊維サイズが増加し、凝塊構造が劇的に変化した（コントロール vs PS 0.05mg/mL clot, p< 0.0001 ）。 外因性t-PA存在下での我々の血漿凝固溶解研究は、UHRAがプロタミンと異なり凝固分解を促進しないことを実証した。 UHRAは、抗凝固処理したPRP（ヘパリン処理）中のトロンビン値を回復させ、その有効性を示しました。

結論と意義

今回の研究により、万能ヘパリン解毒剤UHRAは、プロタミンと比較して、フィブリノゲン、フィブリン重合、血栓構造、血栓分解、凝固系にほとんど影響を及ぼさないことが示され、優れた血液適合性があることが明らかとなりました。 この結果は、UHRAが侵襲的な外科手術後の止血回復やヘパリン系抗凝固剤による出血性合併症に対処するための理想的な解毒剤となる可能性を支持するものです。

図3

No relevant conflicts of interest to declare to be continued.