ガーリックエキス
熟成ガーリックエキス
生のにんにく球根よりも無臭で抗酸化物質を豊富に含むにんにくの代替源は、にんにくサプリメントの中でも最も有名なAGEである。 AGEは加工されたニンニクを濃縮したもので、多くの科学的研究により、安全かつ効果的に健康効果を発揮することが示されています。 AGEに起因する肝保護作用、免疫強化作用、抗がん作用、化学予防作用などの付加的な生物学的効果は、長期の抽出過程で形成されるS-アリルシステイン（SAC）、S-アリルメルカプトシステイン（SAMC）、N（α）-フルクトシルアルギニン（FruArg）、サポニンなどの化合物に起因すると考えられています。 ニンニク製剤は、チオスルフィネート（アリシンなど）のような臭気成分を含んでいなくても有効であり、これらはどのような加工を行っても分解され消滅する。 アリシン様過渡成分は直接的な活性はないが、利用可能なデータでは、SACのような生物学的に利用可能な成分で標準化されたアリシンフリーのニンニク製剤は活性があり、ニンニクの様々な効果はそれに起因すると考えられる（Amagase、2006）＜6532＞ ＜6945＞AGE は免疫調節作用や抗酸化作用を含む様々な生物活性がある。 非処方の滋養強壮剤、風邪予防の薬や栄養補助食品の主成分として使用されています。 AGEは湧永製薬からキョーリックという商品名で販売されています。 AGEは、その名が示すように、ニンニクの熟成によって製造される。新鮮なニンニクをスライスして浸漬し、15〜25％のエタノール中に常温で18〜20ヶ月間保存する（Lawson, 1993）。 培養液または抽出液は、その後ろ過され、乾燥するまで濃縮され、さらなる研究のために-20℃で保存される。 ニンニク抽出物を長期間熟成させると、化学変化が起こる(Lawson and Wang, 1995)。 アリシン、γ-グルタミル-S-1-プロペニルシステインのような化合物は、熟成の過程で減少することが分かっています。 AGEは他の市販のニンニク製剤や生のニンニクよりも抗酸化物質が豊富で（Wang et al., 2015）、健康な免疫システムの維持や薬物毒性の予防に役立つグルタチオンや、有害な過酸化物を除去するペルオキシダーゼなど細胞の抗酸化物質を高める作用もある。 AGEの抗酸化活性は、老化の過程でのみ生成されるOS化合物であるSACとSAMCが担っています。
Kyo et al. (1997) は、in vitroヒスタミン放出系、in vivo IgE媒介皮膚反応系、in vivo後期反応系を用いて肥満細胞や活性T-リンパ球の機能へのAGE効果を検討し、AGEは老化の過程でのみ生成されるSACとSAMCが、老化の過程でこそ、その活性を高めることを示しました。 その結果、AGEは炎症を含むアレルギー性カスケード反応に主要な役割を果たすマスト細胞、好塩基球、活性化Tリンパ球の機能を直接的または間接的に修飾する可能性が示唆された（6532）
AGEのマウス血漿中のNO生成（NO代謝物亜硝酸および硝酸として測定）に対する効果に関する研究では、AGE（2.86 g/kg、p.o）は投与後15～60分でNO生成を一時的に30～40％増加した（Moriharaら、2002）。 これらの著者らは、AGEは誘導性NO合成酵素ではなく、構成性NO合成酵素を活性化することによりNO産生を増加させ、心血管疾患の予防に有用なサプリメントであると結論付けた。
10ヶ月以上抽出したAGEは刺激性が少なく、毒性が低い（LawsonとWang、1995）。 いくつかの実験的研究により、AGEは抗酸化作用、抗ストレス作用、免疫調節作用、心血管系、肝保護作用を有することが証明されている（Kasuga et al.） Kyoら（1998）は、AGEが免疫機能の恒常性を維持する重要な免疫調節因子であり、免疫調節を通じて抗腫瘍活性を示す可能性があることを見いだした。 その結果、AGEはマウス脾臓細胞の増殖とサイトカイン（IL-2、TNF-α、IFN-γ）の放出を促進し、NK活性を高め、腹膜マクロファージによる貪食を増強させた。 また、AGEはサイトカインやマイトジェンに対するリンパ球の反応性を刺激した。
心理的ストレスモデルにおいて、AGEは電気的ストレスによる脾臓重量の減少を有意に防ぎ、抗ヒツジ赤血球（SRBC）溶血PFCの減少を回復した。これらの結果は、心理的ストレスは免疫機能を質的、量的に障害し、AGEは心理的に誘発される障害を防ぐのに非常に有効であると示した（京ら、1999）。 IgE介在性アレルギーモデルマウスにおいて、AGEは塩化ピクリル塗布および抗トリニトロフェニル抗体の静脈内投与により誘発される抗原特異的耳腫れを有意に抑制した（Kyo et al.、2001）。 移植癌細胞モデルでは、AGEはマウスに移植されたSarcoma-180（同種）細胞およびLL/2肺癌（同種）細胞の増殖を有意に抑制した。 AGEを投与したSarcoma-180搭載マウスでは、脾臓細胞のNKおよびキラー活性の増加が観察された。
大腸腺腫（n=51）に対するAGEの効果を確認するため、田中ら（2004）は高AGE（AGE 2.4 mL/日）および低AGE（AGE 0.16 mL/日）投与によるダブルブラインドランダマイズ試験を行った。 摂取前（0ヶ月）、摂取後6ヶ月、12ヶ月の腺腫の数と大きさから、大腸腺腫に対する抑制効果の可能性が示唆された。 この結果は、AGEの大腸腺腫に対する予防・治療効果の可能性を示唆しているが、より大規模かつ長期の試験で検討する必要がある（田中ら、2004、2006）。
手術不能の大腸がん、肝臓がん、膵臓がんの患者（n=50）に、AGEと他のグループに6カ月間プラセボを投与した無作為二重盲検試験において、1つのグループは、大腸腺腫の予防・治療効果を示した。 QOLに差はなかったが、NK細胞数、NK細胞活性ともにAGE群で有意に増加した（石川ら、2006）。この試験から、消化器系の進行がん患者にAGEを投与することでNK細胞活性が向上することが示された。 AGEは3種類の大腸がん細胞株（HT29、SW480、SW620）の増殖を同様に抑制したが、SW480とSW620細胞のみの浸潤活性はAGEにより抑制された（Matsuura et al.） これらの結果は、AGEが内皮細胞の運動、増殖、管形成の抑制を通じて血管新生を阻害し、腫瘍形成を予防する可能性を示唆するものであった。 Matsuuraら（2006）は、AGEが大腸癌細胞に対する抗増殖作用と血管新生に対する抑制作用を有することから、大腸癌の化学予防剤として優れていることを示唆している。
1,2-ジメチルヒドラジン（DMH）誘発大腸腫瘍性ラットにおけるAGEによる大腸発癌および細胞増殖に対する化学予防効果が検討されている（Katsukiら、2006）。 ラットに毎週 DMH（20 mg/kg、s.c.）を 20 週間投与し、基本食または 4％の AGE を含む食餌を摂取させた。 AGE処理したラットの血清には検出可能なSACが含まれていた。 AGEは細胞増殖の抑制を通じて大腸発がんの化学予防効果を有することが示唆された。 その結果、AGEは、洗浄液中の好酸球割合、肺気管支周囲の好酸球、洗浄液および血清中のIgG1レベル、粘液産生性杯細胞のグレード、気管支および血管周囲の炎症などのアレルギー性気道炎症レベルの特徴的な基準を有意に低下させることが示されました。 Zareら（2008）は、AGEはマウスモデルにおいて、アレルギー性気道炎の炎症特徴を減弱させる可能性があると結論付けている。
マクロファージ上のCD36スカベンジャー受容体の発現は、動脈硬化性病変発生中の酸化低密度リポ蛋白の取り込みとフォームセル形成に関与している。 森原ら（2010）は、細胞内の総チオンとグルタチオン濃度を上昇させるAGEが、ヒト単球やマクロファージ（THP-1細胞や初代ヒト単球）のCD36発現に与える影響を検討した。 彼らのデータは、AGEがヒトマクロファージおよび単球からマクロファージへの分化におけるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ（PPARγ）経路を調節することによってCD36の発現を抑制することを示している。
マウス前胃癌を有する昆明マウスにおいて、熟成黒ニンニクエキス（AGE）を2週間腹腔内投与すると、接種した腫瘍の成長抑制など、AGEの有意な抗腫瘍効果が観察されることが示された（Wang et al, 2012). さらに、血清中のスーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、IL-2、脾臓および胸腺の指標の上昇を調べたところ、ABCEの抗がん作用は抗酸化作用および免疫調節作用によるものである可能性が示唆された。
最近の研究では、AGE（100 mg/kg、i.p.）の投与により、BALB/cマウスの皮下に移植したWEHI-164線維肉腫腫瘍に対する免疫反応が改善したことが示されています（Fallah-Rostami et al, 2013; Tabari and Ebrahimpour, 2014）。 AGEを投与されたマウスは、対照マウスと比較して、有意に長い生存時間を有する。 また、AGE投与マウスでは腫瘍増殖抑制効果が認められた。 脾臓細胞のCD4+/CD8+比およびin vitro IFN-γ産生は、AGE投与群で有意に増加した。 AGEマウスの脾臓細胞のWEHI-164特異的細胞傷害性も有意に増加した。
オピオイド受容体拮抗薬のNaltrexone（NTX）は免疫調節作用と抗腫瘍作用を持つ。 最近、AGE（100 mg/kg、i.p.）は、WEHI-164線維肉腫腫瘍の成長抑制および生存時間の増加に対してNTX（0.5 mg/kg、i.p.）との相乗効果を示すことが判明した（Ebrahimpourら、2013年）。 AGE+NTXを投与したマウスは、AGEまたはNTX単独で投与したマウスと比較して生存期間が有意に長く、併用療法群では腫瘍増殖抑制効果の増強が認められました。 脾臓細胞のCD4+/CD8+比およびin vitro IFN-γ産生は、AGE+NTX群およびNTX群で有意に増加した。 AGE+NTX投与マウスでは脾臓細胞のWEHI-164特異的細胞傷害性も有意に増加した。
DMH誘発発癌のF344ラットのグループに3% w/wのAGEを含む基礎食を与えたところ、総腫瘍病理に変化はなくACF数の減少が見られた（Jikihara et al, 2015）． AGEは組織学的解析により腺腫および腺癌病変の数が少なく、免疫組織化学染色によりAGEは腺腫および腺癌病変の増殖活性を抑制したが、正常結腸粘膜には影響を示さなかった。 さらに、著者らは、AGEがヒト大腸がん細胞において、NF-κBの不活性化を介してサイクリンB1およびcdk1の発現を抑制することにより細胞周期の進行を遅らせるが、アポトーシスは誘導しないことを実証しています。 Nantzら（2012）は、AGEが細胞の増殖や活性化、炎症に及ぼす影響と、それらの変化が風邪やfluの発生や重症度に影響するかどうかを調査しました。 風邪やインフルエンザが流行する季節に、健康なヒト被験者（n=120；21-50歳）にAGE摂取（2.56g AGE/日）またはプラセボサプリメントを45日間与えたところ、プラセボ群の細胞よりもγδT細胞とNK細胞の増殖が良く、活性化が確認されました。 90日後、罹患数に有意な差はなかったものの、AGE群では風邪やインフルエンザの重症度が低下し、罹患数が減少したことが確認されました。 AGE群では、風邪とfluの重症度が低下し、(1) 症状、(2) 機能低下日、(3) 仕事や学校に行けない日数が減少した。 これらの結果は、AGEサプリメントが免疫細胞の機能を高め、風邪やfluの重症度が低下する一因となり、おそらく付随する炎症が少ないことを示唆した（Nantz et al, 2012; Percival, 2016）。
熟成ニンニクエキス（AGE）中のOS化合物の免疫調節特性
一般にAGEは、スライスしたニンニクを15～20％の水性エタノールで20ヶ月間保存し、その後ろ過して濃縮して調製する（Hirao et al.、1987）。 最終的な液体抽出物には10%(w/v)のエタノールと少量の水溶性OS化合物(Lawson, 1993)が含まれると報告されており、これらは表14.1に記載した通りである。 最近、AGE中のOS化合物の定性・定量分析のために、ヘキサオドプラチナート試薬を用いた迅速なポストカラムHPLC法が開発された（Matsutomo and Kodera, 2016）。 本法は，非硫黄化合物からの干渉が少なく，高感度で相関係数も良好であり，ニンニク製剤中の複数の異性体を含む>20種類のOS化合物を1回の操作で分離できる高分解能を有するという利点がある。 シス-S-1-プロペニルシステイン（シス-S1PC）とγ-グルタミル-S-アリル-メルカプトシステインの同定は、AGEで可能でした
Table 14.1. 熟成ニンニク抽出物中の有機硫黄（OS）化合物の含有量（Lawson, 1993）＜6532＞＜4271＞＜8244＞＜9989＞＜6262＞＜5830＞Organosulfur Compound＜6123＞＜5830＞Amount (mg/g)＜6123＞＜5539＞＜8466＞＜2162＞＜1220＞S-Allyl cysteine (SAC)＜6384＞＜1220＞0.30
S-メチルエステル（SMC）
S-Alyl mercaptocysteine (SAMC) 0.04
Lee et al. (1994) は、ニンニクおよび/またはAGEの天然成分で悪性細胞を抑制することが知られているチオアリル化合物が正常細胞の増殖も抑制できることを明らかにした。 ニンニクOS化合物は、発癌物質の活性化を抑制し、第2相解毒プロセスを後押しし、G2/M期における細胞周期停止を引き起こし、ミトコンドリアアポトーシス経路を刺激し、ヒストンのアセチル化を増加させる（Iciekら、2009）。 さらに、これらの研究者は、細胞の酸化還元状態の調節、シグナル伝達への関与、スルファン硫黄や混合ジスルフィドの形成によるタンパク質の翻訳後修飾（S-チオール反応）など、OS化合物の分子作用についてあまり知られていない他の側面についても発表している。
OS化合物のがん細胞の増殖と生存を妨げる能力は、硫黄鎖の長さと密接な相関があることが分かっています。 利用可能なデータは、微小管ネットワークの変化によるがん細胞の有糸分裂停止のメカニズムを支持しており、おそらく重要な制御機能を制御するさまざまな細胞高分子のチオール基に対する硫黄原子の高い反応性の結果である (Cerella et al..)。
ATP-binding cassette transporter A1 (ABCA1) は、脂質負荷マクロファージにおける apoA-I へのコレステロール排出の主要メディエーターであり、生体内での逆コレステロール輸送の最初のステップであり、動脈硬化の予防に重要なステップとなります。ABCA1 の発現強化により泡沫細胞の形成が抑制され、結果として動脈硬化のリスクを低減できると考えられています。 ある研究では、SACがヒトTHP-1マクロファージにおけるABCA1発現を増加させ、逆コレステロール排出の促進に有益である可能性が示された（Malekpour-Dehkordiら、2013）＜6532＞＜6945＞Schäfer and Kaschula（2014）は最近、ニンニクOS化合物の免疫調節活性とがんの予防の間の関連性を提案しています。 彼らは、ニンニクが抗炎症および抗酸化反応を誘発し、出現した腫瘍の撲滅に向けて生体をプライミングするのを助けるという仮説を立てている。 最近の研究では、Yooら（2014）は、RBL-2H3細胞におけるIgE媒介アレルギー反応の抑制およびin vivo受動皮膚アナフィラキシーに対する熟成黒ニンニク（ABG）の効果を調査しました。 これらの著者らは、ABGがアレルギー反応を抑制し、その抗アレルギー作用のメカニズムには、Syk、細胞質ホスホリパーゼA2（cPLA2）、5-リポキシゲナーゼ（5-LO）、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）の抑制が関与すると結論づけている。 ABG、酢酸エチル抽出物またはABGの活性画分の抗アレルギー作用は、アレルギー疾患に対する機能性食品として有用であることを示唆している（Yooら、2014）＜6532＞＜6945＞最近の研究では、SACおよびS1PCの腸内IgA産生に対する効果が調査された（Suzukiら、2016）。 S1PCはマウス脾臓リンパ球の培養におけるIgA産生を促進したが、SACは無効であった。 また、S1PCをマウスに5日間経口投与すると、腸管洗浄液中のIgA濃度とパイエル板におけるIgA産生細胞数が増加した。 さらに、S1PCはパイエル板において形質細胞分化誘導因子であるX-box binding protein 1 (Xbp1) mRNAの発現を誘導することが確認された。 これらの結果から、S1PCは腸内でErk1/2を介したXbp1の発現を促進することによりIgA産生細胞を増加させることが示唆された（Suzuki et al, 2016）。
AGE中のタンパク質の免疫調節特性
森岡ら（1993）は、AGEのタンパク質画分がNK細胞活性と腫瘍細胞に対するマクロファージの細胞傷害性を高め、IL-2とコンAを介したヒトリンパ球の増殖も高まったことを報告した。
ニンニクの熟成中に生じるタンパク質画分の変化を調べたところ、4週間まではタンパク質が徐々に上清に放出され、その後、タンパク質濃度は約2mg/mLで安定することがわかりました（図14・3、曲線A）。 濾過・風乾後、残存するニンニクを再抽出すると、より緩やかではあるが再びタンパク質が放出され、5ヶ月後にはタンパク質濃度が〜0.5 mg/mL で安定することがわかった（図 14.3, 曲線 B）。 AGEをさまざまな時期にSDS-PAGEで分析したところ、12〜14 kDa領域の3つの主要タンパク質のみが確認された。通常、生ニンニク100 gから始めて、AGEからは〜25 mgのタンパク質が得られた（Chandrashekar and Venkatesh, 2009）。 QA-1, QA-2, QA-3 の 3 種類のタンパク質が pH8 の Q-Sepharose クロマトグラフィーで分離され、いずれも免疫調節活性とマンノース結合活性を示したが、 QA-2 が最も高い分裂促進活性を示していた。 QA-2およびQA-1のImPは、それぞれニンニクレクチンASA IおよびASA IIと同一であることが特異的血球凝集活性によって確認されている（図14.4）。 QA-3は分裂促進活性を示すが、血球凝集活性はない。これはおそらくホモダイマーのサブユニットが1つ足りないためである（Chandrashekar and Venkatesh, 2009）
図14.3． 25℃の25%エタノールでニンニクを熟成または再抽出した際の上清のタンパク質含量。 タンパク質はブラッドフォードアッセイで定量化した。 曲線(A)。 25℃、25%エタノール中でのニンニクの熟成中のタンパク質の定量；x軸は週数で示す。 曲線(B): 再抽出した残留ニンニク中のタンパク質の定量；x軸は週ではなく月で記す。
図14． 熟成ニンニク抽出物からの低分子フルクタン（<3 kDa; LF）および高分子フルクタン（>3.5 kDa; HF）の分離のためのフローチャート。 ASA IとASA IIは、熟成ニンニクエキス（Chandrashekar and Venkatesh, 2009）と生ニンニク（Clement et al, 2010）の両方に存在するニンニクレクチン（Allium sativum agglutinins I and II）を示す。 Chandrashekar, P.M., Prashanth, K.V., Venkatesh, Y.P., 2011.より許可を得て転載。 熟成ニンニク抽出物からのフルクタンの単離、構造解明、免疫調節活性。 Phytochemistry 72, 255-264. © 2010 Elsevier Ltd.
Ahmadabad ら（2011）は、AGE から分離した半精製 14 kDa タンパク質は BALB/c マウス脾臓から分離した樹状細胞（DC）の CD40 分子の発現を増加するが、CD86 および MHC-II 分子には影響を与えないことを示している。 さらに、同種混合リンパ球反応試験において、14 kDaタンパク質でパルスしたDCとパルスしていないDCでは、有意差は認められなかった（Ahmadabad et al.） Daneshmandiら（2011）は、ニンニクのタンパク質画分の腹膜マクロファージへの影響を評価し、精製した14-および47-kDaタンパク質画分は、刺激したマクロファージの有意な増殖を示さないことを発見しました。 14-kDaおよび47-kDaタンパク質画分は、いずれもマクロファージからのNOの産生を有意に抑制した。 WEHI-164線維肉腫細胞に対するマクロファージ上清の細胞毒性は、ニンニクタンパク質画分によって影響を受けなかった。 AGEの14kDa画分、47kDa画分ともにマクロファージからのNO産生を抑制することができ、マクロファージに対する細胞毒性は示さず、マクロファージの殺腫瘍性を高めることはないようです。
別の研究では、DC表面マーカーの発現に対するAGEから抽出した精製47kDaたんぱく質の効果を評価しました（Hasan et al.、2012). 47kDaタンパク質を処理したDCは、非処理DCと比較してCD40、CD86、MHC-IIなどのDC成熟マーカーの発現を低下させたが、両群間に統計的な差は観察されなかった。 47 kDaタンパク質でDCを処理すると、DCはコスティミュレーションとMHC-II表面分子の発現を低下させ、これは寛容性DC表現型と類似していた。 これらの結果に基づき、Hasanら（2012）は、47 kDaタンパク質がin vitroで寛容性DCを生成する潜在的な候補として利用できることを示唆している。
AGE中のフルクタンによる免疫調節
AGE中のフルクタン量は、生ニンニクの総フルクタン量のごく一部（0.22%）であった。 AGEからは高分子量（>3.5 kDa; HF）と低分子量（<3 kDa; LF、10単位のオリゴ糖）のフルクタンが分離されており（図14.4）、NMR構造解析の結果、どちらも非還元末端でグルコースに（2→1）β-dフルクトフラノシル結合を持ち、バックボーンでβ-d-フラクノシルの分岐を持つことが判明した(Chandrashekar et al., 2011) HFとLFはともにマクロファージの貪食を含む活性化とマイトジェニック活性を示し、これらのin vitro活性はザイモサンやマンナンなどの既知の多糖類免疫賦活剤に匹敵するものであった。
AGEから分離したニンニクフラクタン（AGF）は、BALB/cマウスにOVA（30μg：実験抗原）を経鼻または経口で粘膜投与すると、有意な液性応答（血清IgG）を生じ、経鼻投与では、AGF30μgで50日目に遅延した応答が出現しました。 一方，経口投与では，100 μg AGF投与で35日目に血清IgG反応が早期に認められた． また，より高濃度のAGF（>50 µg）は経鼻投与によるアジュバント活性の阻害を示した． これらの観察から、体液性免疫反応は遅れるものの、AGFは試験抗原に対して免疫アジュバント活性を示すことが示されました（Chandrashekar and Venkatesh, 2012）。
AGEにおけるFructosyl-Arginine（FruArg）が及ぼす免疫調節
アミノ酸と糖のアミノカルボニル反応（メイラード）は食品の加工、調理、貯蔵中に起こる非酵素性の褐変反応であり、AGEはこの褐変反応を抑制します。 FruArgなどのメイラード反応生成物は、抗変異原性および抗酸化活性を含む興味深い化学的および生物学的特性を有することが示されている（Ideら、1999）。 Zhouら（2014）は、AGEとFruArgの両方が、LPS活性化マウスBV-2ミクログリア細胞におけるリポポリサッカライド（LPS）誘発NO産生を有意に阻害できることを示した；AGEおよびFruArg処理に応答するタンパク質の〜78％は共通しており、AGEおよびFruArgでの処理によって異なる影響を受けるタンパク質が炎症反応およびNrf2媒介酸化ストレス応答に関わっていることが示唆された。 AGEとFruArgは、NO産生を抑制し、酸化ストレスに関連する複数のタンパク質標的の発現を調節することにより、BV-2ミクログリア細胞において神経炎症反応を減弱し、回復力を促進すると思われる＜6532＞。
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