エレクトロポレーションと競合するトランスフェクション法

Angelo DePalma Ph.D. Writer GEN

エレクトロポレーションは汎用性が高いため、どんな細胞、どんな生物にも有効ですが、他にはない優位性を備えています。 この技術は、細胞膜の完全性を維持するリン脂質二重層間の弱い相互作用を利用する。 一般的な細胞膜では、リン脂質は極性頭部が外側を、疎水性尾部が内側を向くように配列されており、極性分子の通過を妨げている。

細胞が制御された電気パルスを受けると、リン脂質層が開き、分子が入り込むことができる一時的な物理チャネルが形成される。

遺伝子の直接導入に加えて、エレクトロポレーションは細胞または種間のプラスミドの直接移送を促進します-たとえば、バクテリアから酵母へなど。 この記事では、非医療用途に焦点を当てています。

エレクトロポレーションは、安定したトランスフェクションも可能ですが、一過性に細胞をトランスフェクトするために最も一般的に使用されています。 バイオ医薬品業界では、一過性のトランスフェクションにより、特性評価や前臨床研究のために最大数グラムのタンパク質を生産することができます。 この用途では、プラスミドを利用したエレクトロポレーションが信頼性が高く、予測可能であることが証明されています。

One Technique among Many

エレクトロポレーションは、ウイルスベクター、化学または試薬ベースの方法、および機械的遺伝子導入などのトランスフェクション技術の武器としてしっかりと定着しています。 ウイルスベクターは、治療用タンパク質の製造のために、安定的にトランスフェクトされた細胞を生成するための最も一般的な方法である。 ウイルスベクターは、非常に高いトランスフェクション効果を発揮するが、挿入するDNAの長さに制限がある。

マイクロプレシピテーション、マイクロインジェクション、リポソーム、パーティクルボンバードメント、ソノポレーション、レーザー誘発ポレーション、ビーズトランスフェクションなどの他の機械的技術もすべて実験的に採用されている。 これらの機械的手法には共通項がある。 それらは細胞膜を破壊し、それによってDNAを細胞内に侵入させる。 例えば、「遺伝子銃」のように、膜を通して細胞質へ直接遺伝子を投射する方法もある。 1697>

さらに、機械的および化学的トランスフェクション法の能力を活用したハイブリッド技術もある。 たとえば、化学的トランスフェクションと機械的方法を組み合わせたトランスフェクション方法であるマグネトフェクションについては、過去 10 年間に多数の論文が発表されている。 例えば、カチオン性脂質は、遺伝子銃やエレクトロポレーターと組み合わせて配備されることがある。

エレクトロポレーションには、汎用性(あらゆる細胞タイプに対応)、効率、非常に低いDNA要件、および生体内で動作する能力といったいくつかの利点がある。 しかし、化学的、機械的、およびウイルスによるトランスフェクションアプローチの中で、エレクトロポレーションは、標的細胞または生物にかかわらず、合理的な成功の確実性を提供するだけである。 後者では、まず、電流が細胞に到達するように緩衝塩を除去して細菌を「コンピテント」にする必要があり、その後、微生物へのダメージを軽減するために0℃で電気パルスを印加する。 化学的形質転換では、CaCl2中に懸濁して孔を開け、その後、熱ショックでDNAを細胞内に掃き出す。 エレクトロポレーションは、化学的なトランスフェクションよりも面倒がなく効率的で、より多様な細胞種に対応でき、標準的な手法になじみやすい。 1697>

Enabling Innovation

1965年に初めて記述されたものの、エレクトロポレーションは機器、プロトコル、実験の面で、革新的な科学への道を開き続けている。 少なくとも12の大学グループが、微小電気機械システム (MEMS) をベースにしたエレクトロポレーション装置を開発している。 マイクロチャネル型デバイスの利点の1つは、妥当な高分子の組み込みを達成するのに十分な電圧しか印加しないように設計することができることである。 しかし、この利点は欠点でもある。 Shengnian Wang博士が率いるルイジアナ工科大学バイオメディカル工学科のグループは、金ナノ粒子が市販のエレクトロポレーション装置の性能を高めることを発見しました1。Wang博士は、高導電性の粒子が、リン脂質膜を開くのを助ける「仮想マイクロ電極」として機能しながら細胞培地の導電性を低下させると考えています。

Charité Universitätsmedizin Berlinの研究者たち2 は、細胞の再現性のあるトランスフェクションのために、矩形パルスエレクトロポレーションを組み合わせた戦略を開発しました。 Britta Siegmund医学博士と共同研究者は、細胞を緩衝液に懸濁し、最初の高電圧パルスに続いて、電気的・時間的に値の異なる低電圧パルスを印加した。 Siegmund博士は、生存率は標準的なエレクトロポレーションと同等であり、トランスフェクション効率は最大95％であると主張している。 この技術は「トランスフェクションが困難と考えられる細胞にも容易に適用できる」と結論づけている。

一般的なDNA導入に加えて、トランスフェクションはさまざまな種類の細胞への干渉RNA導入に採用されている。 この技術により、投与量と送達効率の制御された小規模な研究が可能になる。 投与と送達の問題は、治療における実用的なRNA干渉の応用を悩ませてきた。 エジンバラ大学のKirsty Jensen博士らは、ウシ単球由来マクロファージにおける免疫調節性地中海熱遺伝子（MEFV）のサイレンシングについて、11種類の一過性トランスフェクション試薬キットとエレクトロポレーションの有効性を比較検討しました。 研究グループは、小干渉RNAの取り込み、標的遺伝子のノックダウン、細胞毒性、I型インターフェロン反応の誘導に関する方法論をテストした。

エレクトロポレーションは、MEFVのノックダウンにおいてトランスフェクション試薬とほぼ同じ効果があった。 試薬とは異なり、エレクトロポレーションはインターフェロン反応を誘導しないが、細胞生存率は低かった。

Jensen博士は、「トランスフェクション試薬の使用は、感染に対する反応における宿主マクロファージ遺伝子の役割を調べる我々の仕事には、エレクトロポレーションよりも適している」が、「小干渉RNAを細胞にトランスフェクトするかエレクトロポレーションするかの選択は、個々の実験によって異なる」と結論づけた。”

エレクトロポレーションの結果が最適でない少なくともいくつかの例では、研究者は電気パルス強度以外の条件を最適化することを怠ってきた。 Huと共同研究者によって最近指摘されたように4、エレクトロポレーションの効果は、細胞や組織のタイプやDNAフォーミュレーションなどの非電気的要因に影響される」

エレクトロポレーションは、in vitroとin vivoの両方の発生生物学に不可欠な方法となっている。 この作業の大部分は単一細胞で行われ、治療、診断、ドラッグデリバリー、および細胞生物学において非常に興味深いモデルに貢献している。 ノースウェスタン大学の研究者たちは、高い生存率と効率を実現する単一細胞技術を開発した5。彼らのアプローチは、微細加工されたカンチレバー装置、ナノファウンテンプローブ（NFP）を用いる。 NFPは、バルクマイクロインジェクションやナノポーレーションよりも穏やかに分子を細胞に送り込むことができる。 研究者らは、NFPを介した単一HeLa細胞のエレクトロポレーションにより、95%以上のトランスフェクション効率、92%の生存率、および質的な投与量制御を実証した。 原子間力顕微鏡に基づく技術は、しばしば細胞の接着を失ったり、破裂させたりすることがある。 NFPは、細胞へのダメージが少ない。