γ-グルタミルトランスペプチダーゼ

活性と特異性

したがって本酵素が触媒する反応は、一般には反応条件によって水、アミノ酸、ジペプチド、γ-グルタミル供与体自身など種々の受容体分子にγ-グルタミル基を移行させるものとして理解される。

天然基質であるグルタチオンとその誘導体の構造から予想されるように、GGTはγ-グルタミル部分を厳密に認識するが、脱離基（Xaa）に対してはかなり広い基質特異性を持っている。 グルタチオン、そのS-共役体、グルタチオンジスルフィド、γ-グルタミルジまたはトリペプチド、グルタミン、γ-グルタミルアミドのl-α-メチル誘導体、ロイコトリエンC4、ポリ-γ-グルタミル誘導体はすべて基質として認められる 。 l-γ-グルタミル-p-ニトロアニリド（l-γ-Glu-pNA）、蛍光l-γ-7-アミノ-4-メチルクマリン（l-γ-Glu-AMC）などの人工基質は、γ-グルタミル受容体（下記参照）の存在下または非存在下でそれぞれトランスペプチダーゼまたはヒドロラーゼアッセイによく用いられる活性基質である。

アクセプターに対する基質特異性は、ラット腎臓のGGTで最も広範囲に研究されている。 中性アミノ酸のl-異性体であるl-cystine, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys, l-Serなどは良いアクセプターであるが、疎水性アミノ酸や分岐鎖アミノ酸である l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile, l-Val はむしろ悪い基質であり、d-アミノ酸やα置換アミノ酸はアクセプター基質として作用しない。 したがって、d-γ-Glu-pNAを用いることは、ヒドロラーゼ活性を測定する際に、自己脱離を抑制するのに便利な方法である。 アクセプター結合部位はグルタチオンのCys-Gly部位と重なるため、本酵素はC末端にGlyを持つジペプチド、例えばl-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly および l-Ser-Gly を相対的活性の降順に好んで基質に選択する . 2つ以上のアミノ酸残基を持つペプチドは非常に貧弱なアクセプターである。 アミノ酸やジペプチドのKm値は0.1〜5 mMと比較的高いが、Gly-Gly (Km=3 mM)がトランスペプチダーゼ活性のアクセプター基質として最も簡便に使用される。 高濃度のアクセプター分子はγ-グルタミル供与体（γ-Glu-Xaa）に対して競合的にGGTを阻害するが、これはXaaとアクセプターの結合部位が重なっているためであろう。 Cysサブサイトに対する基質特異性は酵素の由来に依存し、例えば大腸菌の酵素はこの部位に塩基性アミノ酸（l-Arg, l-Lys, l-His）および芳香族アミノ酸（l-Phe, l-Trp, l-DOPA）を好む …。 しかし、見かけの活性は、そのpHで利用可能な脱プロトン化アミノ酸の有効濃度にも依存するため、アクセプター特異性には注意が必要である。 Gly-Glyの活性が比較的高いのは、このジペプチドのpKaが低いことが一因である。

酵素の測定に最も広く用いられているドナー基質はl-γ-Glu-pNAである。 ラット腎臓酵素のトランスペプチダーゼ活性を測定するための典型的な混合物は、5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly in 0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 25℃である。 十分な濃度のGly-Glyを添加することにより、加水分解と自己消化を効果的に抑制することができる。 GGTの至適pHはトランスペプチデーションでは約7.5-9であるが、加水分解ではpH依存性が非常に小さい 。 このことは，見かけのトランスペプチダーゼ活性が，アクセプターの遊離アミノ基の有効濃度に一部依存していることと矛盾しない．

グルタミンに対するヒドロラーゼ活性は，マレイン酸，ヒップレート，グリココレートのような受容体部位特異的モジュレーターを添加すると最大で12倍増加する． これらの化合物の添加により、アクセプター基質とCys-Glyサブサイトを占めるγ-グルタミルドナーの結合が阻害される。 γ-グルタミルドナーの添加やγ-グルタミルドナー部位での阻害剤の結合は、これらの調節剤の親和性を高めることから、γ-グルタミルドナーとアクセプターの結合部位間の協調的相互作用が示唆される（総説はTate & Meister参照 ）。 これらの調節因子が占めるアクセプター部位は、GGTの活性型へのコンフォメーション変化を促進し、それによって遷移状態の形成を容易にすることが示唆される。 このことは、アシビシンによる哺乳類酵素の不活性化率の上昇を説明するためにも提案されている（下図）。しかし、活性部位指向性の遷移状態アナログ親和性ラベルであるγ-モノフルオロホスホン酸による阻害では、この現象は観察されなかった . アシビシンは哺乳類GGTの触媒求核性残基以外の求核性残基に結合するようである。

GTはl-およびd-γ-glutamyl-(o-carboxy)phenylhydrazide (Penicillium oxalicumが生産するアントグルチン）によって8 μMのKiで可逆的かつ競争的に阻害し、マウスに対して急性毒性が報告されない …。 また、γ-カルボキシ付近に反応基を持ついくつかのグルタミン酸アナログは、不可逆的な阻害剤として作用する。 6-Diazo-5-oxo-l-norleucine（DON）、O-diazoacetyl-l-serine（l-アザセリン）およびl-（αS、5S）-α-3-chloro-4，5-dihydro-5-isoxazoleacetic acid（acivicin または AT-125、 Streptomyces sviceus により生産）は強力だが非特異的にGGT を不活性化する物質である． アシビシンは、ヌクレオチド、アミノ酸、アミノ糖の生合成に関与する多くのグルタミンアミドトランスフェラーゼを不活性化するため、非常に毒性が高いが、in vivoでのGGTの活性抑制に広く使用されている ……。 セリンホウ酸複合体は、γ-グルタミル結合部位に可逆的に結合し、20μMのKiでGGTを阻害する . この古典的な発見により、強力でゆっくりと結合する阻害剤、l-2-アミノ-3-ボロノブタン酸（γ-boroGlu）が開発された。 GGTは17または35 nMの全体的なKiで阻害されるが、阻害はまだ可逆的である。 2-Amino-4-(fluorophosphono)butanoic acid (γ-PFGlu)は、γ-カルボキシに親電子リンを置換したグルタミン酸アナログで、大腸菌GGTの活性部位指向性アフィニティー標識剤として強力なメカニズムに基づくものである 。 この化合物は GGT を迅速かつ不可逆的に阻害し、安定なアニオン性で四面体の遷移状態様付加物を形成するため、大腸菌 GGT の触媒求核剤を特定するためのペプチドマッピングに適している (vide infra)。 一連のγ-(monophenyl)phosphono-およびγ-phosphonodiester glutamate analogは、その触媒求核剤の共有結合修飾によりGGTを不可逆的に阻害するメカニズムベースの阻害剤である。 特に、Cys-GlyとそのC末端カルボキシ基の構造模倣体を組み込んだγ-phosphonodiesterは、ヒトGGTに対して非常に高い活性を示し、その不活性化速度はアシビシンの130〜6000倍であった。 この阻害はGGTに対して選択的であり、毒性は認められない。 この阻害剤の1つは「GGsTop」（和光純薬工業株式会社）の名称で市販されている。

ハイスループット・スクリーニングにより、ヒトGGTの非グルタミン酸アナログ阻害剤を見いだした。 この化合物はγ-グルタミル基質複合体のアクセプター部位を占め、Kiは17.6μMであった。

GGTが触媒する反応は、セリン加水分解酵素と同様にγ-グルタミル酵素の中間体を介したピンポン機構で進行すると考えられている。 小サブユニットのN末端のThr Oγが触媒の求核剤で、これにγ-グルタミル基が結合している（構造化学の項参照）。 大腸菌のGGTは、γ-PFGluで不活性化した酵素のペプチドマッピングにより、小サブユニットのN末端のThr残基（Thr391）が触媒求核であることが初めて同定された。 この残基は、Thr380（ラット腎臓酵素）とThr381（ヒト酵素）に相当し、一次配列がわかっているすべてのGGTsの中で保存されているものである。 また、γ-(monophenyl)phosphono 標識で不活性化した酵素のペプチドマッピングにより、ヒト GGT の触媒求核点は Thr381 と同定された。 したがって、GGTの触媒反応は、まず小サブユニットのN末端のThr残基がドナー基質（γ-Glu-Xaa）のγ-カルボキシに求核攻撃を受け、Xaaが除去されることから始まる。 こうして生成したγ-グルタミル酵素は、水（加水分解）またはアミノ酸やジペプチド（トランスペプチド化、オートトランスペプチド化）と反応し、律速段階となる。

GTは、そのユニークなフォールドと、触媒的に不活性な前駆体を翻訳後自己触媒的に処理して活性な二量体の成熟酵素を生成する成熟過程から、N末端求核性加水分解酵素（Ntn-ヒドロラーゼ）の一員であると予想された。 このことは、部位特異的変異導入法および細菌酵素のX線構造解析（構造化学の項参照）により確認されている

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