Un antidoto universale all’eparina con un effetto trascurabile sulla fibrina e sulla coagulazione plasmatica

Sfondo e obiettivo

Gli anticoagulanti hanno un ruolo fondamentale nel trattamento dei disturbi tromboembolici. L’emorragia nei pazienti chirurgici che ricevono anticoagulanti è una preoccupazione importante. Gli antidoti vengono somministrati per contrastare l’anticoagulazione e ripristinare la normale emostasi. Ad oggi, il solfato di protamina (PS), un polipeptide cationico, è l’unico antidoto clinicamente approvato per l’eparina non frazionata. PS ha effetti collaterali tossici e limitazioni. L’incapacità del PS di invertire completamente le eparine a basso peso molecolare e il fondaparinux è dovuta alla sua bassa affinità di legame con questi farmaci. Tuttavia, PS interagisce con le proteine della coagulazione come il fibrinogeno per formare aggregati che portano a effetti avversi cardiovascolari. Recentemente, abbiamo sviluppato un agente sintetico universale di inversione dell’eparina (UHRA) con alta affinità di legame alle eparine. Studi in vivo hanno rivelato che UHRA inverte completamente l’attività di tutti gli anticoagulanti parenterali clinicamente disponibili e non è tossico. Questo studio mira a dimostrare la natura non tossica di UHRA valutando la sua influenza sul fibrinogeno, sull’architettura del coagulo di fibrina, sulla coagulazione plasmatica e sulla lisi del coagulo.

Metodi

UHRA è stato sviluppato incorporando gruppi leganti l’eparina a base di ammine terziarie su un’impalcatura dendritica iperbrancata di poliglicerolo e tappandola con catene di polietilenglicole metossi. La ricalcificazione e il fattore di tessuto (TF) hanno avviato saggi di coagulazione del plasma turbidimetrico per capire l’impatto di UHRA sul sistema di coagulazione. L’interazione dell’UHRA sul fibrinogeno è stata studiata mediante il saggio di aggregazione del fibrinogeno, il saggio di polimerizzazione della fibrina e l’analisi spettroscopica (fluorescenza e dicroismo circolare (CD)). L’influenza dell’UHRA sull’architettura del coagulo di fibrina è stata valutata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM). La neutralizzazione dell’anticoagulante (eparine) da parte dell’UHRA è stata studiata mediante un test fluorogenico di generazione di trombina (TGA) in plasma ricco di piastrine umane (PRP). La lisi del coagulo plasmatico indotto da TF contenente UHRA o PS esposto all’attivatore del plasminogeno tissutale esogeno (t-PA) è stata studiata mediante saggio turbidimetrico.

Risultati e discussione

I risultati dei saggi di coagulazione plasmatica hanno mostrato che UHRA non ha alterato i parametri di coagulazione rispetto a PS (tempo di ritardo iniziato da TF e assorbanza massima, controllo vs UHRA 200 mcg/mL, p=0.21 e 0,16, rispettivamente; tempo di ritardo e assorbanza massima nella ricalcificazione, controllo vs UHRA 200mcg/mL, p=0,08 e 0,13, rispettivamente) suggerendo che UHRA non ha effetti sul sistema di coagulazione alla concentrazione studiata (Figura 1). A differenza della protamina, l’aggregazione del fibrinogeno e il test di polimerizzazione della fibrina non sono stati influenzati dall’UHRA in un ampio intervallo di concentrazioni da 0,05mg/mL a 1mg/mL. Insieme alle misure di quenching della fluorescenza del triptofano (Figura 2) e alle misure della struttura secondaria del fibrinogeno, si conferma che l’UHRA non interagisce con il fibrinogeno. I risultati sono molto diversi da PS e altri polimeri sintetici cationici che interagiscono con il fibrinogeno provocando aggregazione e cambiamenti conformazionali. I coaguli di fibrina generati in presenza di UHRA (anche a 0,5 mg/mL) hanno mostrato una struttura simile e la dimensione delle fibre rimane la stessa del coagulo di fibrina normale (controllo vs coagulo UHRA 0,5 mg/mL, p= 0,12) (Figura 3). D’altra parte, i coaguli di fibrina formati in presenza di 0.05mg/mL PS (dose clinica) hanno aumentato la dimensione delle fibre e cambiato la struttura del coagulo in modo drammatico (controllo vs coagulo PS 0.05mg/mL, p< 0.0001). I nostri studi sulla lisi del coagulo nel plasma in presenza di t-PA esogeno dimostrano che l’UHRA non ha aumentato la degradazione del coagulo a differenza della protamina. UHRA ha ripristinato i livelli di trombina nel PRP anticoagulato (eparinizzato) dimostrandone l’efficacia.

Conclusione e significato

I nostri studi dimostrano che l’antidoto eparinico universale, UHRA, ha un impatto trascurabile su fibrinogeno, polimerizzazione della fibrina, struttura del coagulo, degradazione del coagulo e sistema di coagulazione rivelando la sua eccellente emocompatibilità rispetto alla protamina. I nostri risultati supportano il fatto che UHRA potrebbe essere un antidoto ideale per ripristinare l’emostasi in seguito a procedure chirurgiche invasive e per affrontare le complicazioni di sanguinamento da anticoagulanti a base di eparina.

Nessun conflitto di interessi rilevante da dichiarare.