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U.S. Food and Drug Administration

Manuale di analisi batteriologica (BAM) Pagina principale

Autori: Sandra M. Tallent, Reginald W. Bennett e Jennifer M. Hait

Storia della revisione:

  • Giugno 2017 – Il nuovo capitolo 13B è stato aggiunto al Manuale di analisi batteriologica
  • Gennaio 2018 – Correzione del collegamento ipertestuale per il modulo 4 del CDC APHIS/CDC

L’intossicazione alimentare da stafilococco (SFP) è un’intossicazione conseguente al consumo di cibo contaminato da livelli adeguati di enterotossine preformate. I sintomi della SFP si manifestano entro 2-8 ore dall’ingestione e includono nausea, vomito, crampi addominali con o senza diarrea che tipicamente si risolvono entro 24-48 ore. (Argudin et al., 2010). Il numero di persone colpite dalla SFP è solo una stima a causa di diagnosi errate e focolai minori che non vengono riportati. L’ospedalizzazione è rara, ma è stata notata in persone immunocompromesse, in particolare anziani e molto giovani (Scallan et al., 2011).

Gli stafilococchi sono normalmente presenti sulla pelle e sulle mucose umane con circa il 20-30% per la colonizzazione persistente e il 60% per quella intermittente (Kluytmans et al., 2005). Gli operatori alimentari colonizzati da stafilococchi enterotossigeni sono considerati la principale fonte di contaminazione alimentare attraverso il contatto diretto con i prodotti o le superfici di contatto. Anche gli animali come i bovini da latte possono essere portatori di stafilococchi e possono costituire una fonte di contaminazione del latte e dei prodotti lattiero-caseari. Infine, gli stafilococchi presenti nell’ambiente possono essere trasferiti ai prodotti alimentari e fungere da potenziale fonte di contaminazione (Gutiérrez et al., 2012).

Gli alimenti comunemente legati alla SFP includono alimenti trasformati, carne, pollame, latticini e prodotti da forno. Una volta che il cibo è contaminato, possono verificarsi la crescita di stafilococchi e la produzione di enterotossine, soprattutto se non vengono seguite buone condizioni di produzione che impediscono la crescita, come le condizioni di conservazione refrigerata o le fasi di uccisione a caldo come la pastorizzazione (Gutiérrez et al., 2012). Le enterotossine stafilococciche sono stabili al calore e non si denaturano se non esposte a temperature elevate per lunghi periodi, ad es, autoclave a 121°C (250°F) a 15 PSI per 60 minuti (CDC, 2007).

Lo stafilococco aureo è più comunemente legato alle epidemie di intossicazione alimentare da stafilococco, ma anche altri stafilococchi enterotossigeni coagulasi positivi come S. hyicus e S. intermedius sono stati coinvolti nelle epidemie (Hennekinne et al., 2010). Le enterotossine stafilococciche (SE) sono esotossine pirogeniche con attività superantigenica. Le enterotossine sono proteine globulari resistenti al calore e alle proteasi con dimensioni molecolari in media di circa 25 kDa. Le stime sulla quantità di tossina necessaria per causare la malattia sono molto basse. Un focolaio legato al latte al cioccolato ha rilevato livelli di SEA pari a 0,5ng/ml (Evenson et al., 1988) e 0,38ng/ml di SEA è stato rilevato in un focolaio legato al latte in polvere (Asao, et al., 2003).

Le SE classiche (SEA-SEE) e le SE non classiche, SEG, SEH, SEI, SER e SET hanno dimostrato attività emetica. L’attività emetica per le enterotossine SElJ-SElQ, SElS, SElU e SElV deve ancora essere dimostrata. Tutti i geni se e sel sono stati localizzati su elementi genetici mobili tra cui batteriofagi, isole di patogenicità, plasmidi o trasposoni (Argudin et al., 2012).

Il rilevamento di SE è fondamentale per la sicurezza alimentare e la protezione dell’approvvigionamento alimentare. I metodi di rilevamento degli SE si basano su test immunoenzimatici polivalenti (ELISA) o test immunoenzimatici fluorescenti (EFLA) disponibili in commercio con anticorpi che rilevano i SEA-SEE. I metodi monovalenti sono specifici per la SEA-SEE e possono essere utilizzati per distinguere questi tipi. I metodi richiedono l’estrazione dell’enterotossina dal cibo sospetto prima dell’analisi. La sensibilità e la selettività del metodo sono migliorate con la concentrazione per dialisi dell’estratto alimentare, ma i vincoli di tempo possono richiedere test preliminari senza concentrazione. Tuttavia, la concentrazione per dialisi dovrebbe essere eseguita su tutti i prodotti lattiero-caseari prima dell’analisi (Hennekinne et al., 2012).

Attenzione: le enterotossine stafilococciche sono altamente tossiche e le procedure che possono creare aerosol dovrebbero essere eseguite in un armadio di sicurezza biologico approvato (BSC). Le enterotossine stafilococciche (SEA, SEB, SEC, SED e SEE) sono agenti selezionati. Gli scienziati devono seguire le linee guida stabilite dal CDC: https://www.selectagents.gov/faq-general.html.

  1. Attrezzature e materiali speciali
    1. Stanza a temperatura controllata o frigorifero 2-8°C.
    2. Frullatore o omogeneizzatore.
    3. Incubatore 35-37°C.
    4. Bilancia analitica e pesatori.
    5. Vassoio per dialisi.
    6. PH metro. Il pH durante l’estrazione e il pH dei tamponi usati nell’estrazione sono importanti. Effettuare regolazioni entro ± 0,1 unità di pH.
    7. Centrifuga refrigerata 2-8°C.
    8. Vetri da laboratorio in vetro o polipropilene per evitare l’adsorbimento delle tossine.
    9. Telo da filtro è usato per raccogliere i detriti dopo la centrifugazione. Spesso, diversi strati di cheesecloth grossolano pre-umidificato sono utilizzati per svolgere questo compito.
    10. Infuso separatore.
    11. Membrana da dialisi MWCO 6.000-8.000 Dalton (ad esempio Spectra/Por® con chiusure) larghezza piatta 23 ± 2 mm.
    12. Dispositivi di filtrazione a vuoto per tubi conici (membrana da 0,22 µm) come Steriflip (EMD Millipore) raccomandati per filtrare i surnatanti delle colture liquide come misura di sicurezza per evitare l’aerosolizzazione delle enterotossine.
    13. Biological safety cabinet.
  2. Reagenti

    Nota: i produttori di kit possono richiedere buffer o solventi diversi.

    1. Soluzione tampone fosfato (PBS) pH 7.3 + 0.2 (NaCl/Na2HPO4: 145 mM/10 mM) per preparare 1L PBS sciogliere 9 g NaCl e 3.58 g Na2HPO4 in 1L di acqua distillata. Regolare il pH a 7,2 ± 0,2 usando HCl.
    2. Cloruro di sodio (NaCl).
    3. Fosfato di sodio (Na2HPO4).
    4. Polietilenglicole (PEG) (20.000 mol wt) Preparare una soluzione di PEG al 30% (w/v) aggiungendo 30g PEG per ogni 70 ml di acqua distillata.
    5. 1 N (o 0,1 N) NaOH.
    6. 1 N (o 0,1 N) HCl.
  3. Preparazione della membrana da dialisi
    Tagliare la membrana da dialisi abbastanza a lungo da contenere l’estratto alimentare da concentrare. Immergere i tubi in 2 cambi di acqua distillata per rimuovere il rivestimento di glicerolo. Usare una chiusura a membrana o legare un’estremità del tubo con 2 nodi vicini. Riempire il tubo con acqua distillata e verificare la presenza di perdite schiacciando il sacchetto riempito mentre si tiene l’estremità aperta ben chiusa. Svuotare il sacchetto e metterlo in acqua distillata fino all’utilizzo.
  4. Estrazione di enterotossine da porzioni di cibo

    NOTA: questa procedura e altre procedure che possono generare aerosol di microrganismi patogeni o enterotossine devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologico approvato.

    1. Se possibile, macinare l’intero prodotto alimentare o porzioni da selezioni rappresentative del prodotto in un frullatore per omogeneizzare il campione in modo che qualsiasi SE presente nel cibo sia distribuito uniformemente.
      1. Per i formaggi con crosta, prendere un campione di formaggio con il 10% di crosta e il 90% di formaggio.
      2. Per i prodotti secchi, utilizzare quantità uguali di acqua con il prodotto per miscelare o seguire le istruzioni del produttore.
    2. Pesare 25 g di campione in un bicchiere di vetro e trasferire la porzione di test in un frullatore con 40 ml di acqua distillata e miscelare ad alta velocità per 3 minuti generando un impasto omogeneizzato. Non aggiungere acqua ai campioni liquidi, ma procedere al punto 3.
    3. Lasciare diffondere la tossina agitando il campione a temperatura ambiente per 30 minuti.
    4. Acidificare la miscela con 0,1N HCl a un pH compreso tra 3,5 e 4,0. Nota: se il pH scende al di sotto di 3,0 è necessario preparare un’altra porzione da 25 g.
    5. Trasferire il liquame acidificato in provette coniche di propilene da 50 ml. Centrifugare a 3.130 × g per 20 min a 5°C. Si possono usare velocità inferiori con tempi di centrifuga più lunghi, ma la separazione di alcuni alimenti non è altrettanto efficace. La separazione dei materiali grassi è inefficace a meno che il cibo non venga centrifugato a temperatura refrigerata.
    6. Decantare il liquido surnatante in un becher da 800 ml attraverso una stamigna o altro materiale filtrante adatto posto in un imbuto separatore. Se il surnatante non è chiaro, centrifugare di nuovo e decantare il liquido attraverso la stamigna. Testare il pH che dovrebbe essere tra 3,5 e 4,5. Se il pH è corretto, neutralizzare la miscela con 0.1N NaOH per ottenere un pH tra 7.4 e 7.6.
    7. Se il pH è >4.5 ripetere l’acidificazione, ma se <3.0 o=””>9.0 ripetere il processo con un’altra porzione di cibo da 25 g.
    8. A patto che ci sia un campione sufficiente disponibile per ripetere il test, un’aliquota può essere rimossa per lo screening utilizzando un test convalidato (vedi sezione H). Se i risultati dello screening sono negativi, l’estratto rimanente deve essere concentrato con la dialisi e ritestato.
  5. Concentrazione in dialisi dell’estratto
    1. Porre l’estratto in un sacchetto per dialisi preparato. Stendere il sacchetto chiuso in un vassoio e immergere il sacchetto nel 30% (w/v) di PEG. Tenere a 5°C fino a quando il volume non si riduce a 15-20 ml o meno. Questo processo può richiedere 24-72 ore, ma se il volume non si riduce dopo aver tenuto durante la notte, aggiungere PEG in polvere al vassoio. Rimuovere la sacca dal PEG e lavare accuratamente l’esterno con acqua per rimuovere il PEG che aderisce alla sacca. Immergere in acqua distillata per 1-2 minuti. Versare il contenuto in un piccolo becher.
    2. Risciacquare l’interno della sacca con 2-3 ml di acqua distillata (il PBS è usato per il latte e i prodotti caseari) facendo scorrere le dita su e giù all’esterno della sacca per rimuovere il materiale che aderisce ai lati del tubo. Ripetere il risciacquo fino a quando il risciacquo è chiaro. Mantenere il volume più piccolo possibile.
    3. Regolare il pH dell’estratto a 7,4-7,6.
    4. Gli estratti concentrati dovrebbero essere analizzati entro 48 ore e conservati a 3-5°C, altrimenti, congelare gli estratti a 18-20°C e scongelarli completamente a 3-5°C prima di eseguire il test. Alcuni test come il Vidas SET2 richiedono un’analisi immediata.
  6. Test SE da colture batteriche

    I ceppi stafilococcici sospettati di produrre enterotossine possono essere pre-arricchiti in brodo nutriente come TSB o BHI.

    1. Trasferire due o tre colonie morfologicamente simili in 10 mL di brodo nutriente.
    2. Incubare 35-37°C durante la notte su un agitatore orbitale.
    3. Centrifugare le colture 5 minuti 3500 × g a 10°C
    4. Filtrare il surnatante utilizzando un dispositivo di filtraggio a vuoto Steri-Flip con un filtro da 0.22µm o un altro sistema chiuso per evitare l’aerosolizzazione delle enterotossine. Questa procedura deve essere eseguita in un armadio di sicurezza biologica per garantire la sicurezza dello scienziato.
    5. I supernatanti della coltura possono avere alti livelli di SE che sono al di fuori dell’intervallo lineare del kit e possono richiedere la diluizione con PBS.
  7. Segnalazione dei risultati

    La presenza di enterotossina stafilococcica rilevata nei prodotti alimentari deve essere segnalata al Federal Select Agent Program gestito dal Center for Disease Control and Protection (CDC): https://www.selectagents.gov/form4.htmlcompilando il modulo APHIS/CDC 4.

    I risultati positivi devono essere riportati come Enterotossina stafilococcica rilevata in × g (ml) di prodotto. I risultati negativi sono riportati come enterotossina stafilococcica non rilevata in × g (ml) di prodotto.

  8. Note

    Il kit deve essere in grado di rilevare l’enterotossina al livello minimo di 0,05ng/g con alti livelli di sensibilità relativa (>90%) e specificità relativa (>90%).

    La menzione di nomi commerciali o prodotti commerciali nel metodo è esclusivamente a scopo di informazione scientifica e non implica raccomandazione o approvazione da parte della U. S. Food and Drug Administration. Due metodi comunemente utilizzati per il rilevamento di SE includono il Vidas SET2 approvato dall’AOAC (bioMerieux, Inc) che è un test polivalente automatizzato con enzima legato alla fluorescenza (EFLA) che rileva SEA-SEE (Metodo ufficiale AOAC 2007.06 VIDAS SET2 per il rilevamento di Enterotossina Stafilococcica in alimenti selezionati, azione finale, 2010). L’attuale numero di catalogo di Vidas Set2 è Ref. 30705. Il Ridascreen SET Total (R-Biopharm AG) è un test immunoenzimatico manuale eseguito in pozzetti rivestiti con anticorpi polivalenti. Il kit polivalente Ridascreen rileva le enterotossine stafilococciche SEA-SEE ed è stato convalidato e verificato attraverso prove sul ring e studi di convalida di terze parti condotti dal laboratorio di riferimento dell’Unione Europea per gli stafilococchi coagulasi positivi per il mandato del Comitato Europeo di Standardizzazione (CEN) proposto dalla norma ISO 19020. Un kit monovalente Ridascreen Set A,B,C,D,E (R-Biopharm AG) è disponibile, ma questo kit non è stato convalidato da una terza parte. Il numero di catalogo per il kit polivalente Set Total è R4105 (96 test) o R4106 (48 test) . Il numero di catalogo per il kit monovalente SET A,B,C,D,E è R4101.

Interferenze

Reazioni non specifiche possono verificarsi in prodotti alimentari che hanno enzimi endogeni come la lattoperossidasi o la fosfatasi alcalina e interferiscono con kit come il Vidas SET2 che utilizza la fosfatasi alcalina come enzima di rilevamento (Vernozy-Rozand, et al., 2005). Si raccomanda di confermare tutti i risultati positivi con un metodo alternativo che utilizza un diverso enzima di rilevazione. Nel caso del Vidas SET2, un metodo alternativo è il Ridascreen SET Total che utilizza la lattoperossidasi.

Può essere applicato un trattamento termico per rimuovere la fosfatasi alcalina endogena dal campione come segue:

  • Trasferire 600 μL di estratto concentrato in una provetta
  • Caldo 80°C per 2 minuti
  • Ripetere il test Vidas SET2 con il concentrato raffreddato. Può verificarsi una certa perdita di enterotossina.

Se si sospetta un risultato impreciso utilizzando il Ridascreen o un altro kit che utilizza la lattoperossidasi, trasferire 100 μL di estratto concentrato in una provetta. Aggiungere 50μL di soluzioni di substrato e di kit chromagen. Mescolare e osservare per un colore blu-verde. Se appare un colore blu-verde, è indicativo che la lattoperossidasi intrinseca è presente nel campione e ha interferito con il test. Deve quindi essere utilizzato un metodo di rilevamento diverso.

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