Test di permeabilità Caco-2
Domande e risposte sulla permeabilità Caco-2
Si prega di fornire una panoramica del test di permeabilità Caco-2 di Cyprotex.
Le cellule Caco-2 sono ampiamente utilizzate come modello in vitro per prevedere l’assorbimento di farmaci umani. La linea cellulare Caco-2 è derivata da un carcinoma colorettale umano, e quando viene coltivata, le cellule si differenziano spontaneamente in monostrati di enterociti polarizzati.
Le cellule vengono seminate su piastre a più pozzetti e formano un monostrato confluente per 20 giorni prima dell’esperimento. Il giorno 20, il composto di prova viene aggiunto al lato apicale della membrana e il flusso del composto attraverso il monostrato viene monitorato per un periodo di 2 ore. Per studiare l’efflusso del farmaco, è anche necessario studiare il trasporto del composto dal compartimento basolaterale al compartimento apicale.
Il coefficiente di permeabilità (Papp) è calcolato dalla seguente equazione:
dove dQ/dt è il tasso di permeazione del farmaco attraverso le cellule, C0 è la concentrazione del donatore al tempo zero e A è l’area del monostrato cellulare.
Come si interpretano i dati del test di permeabilità Caco-2?
Ci sono diversi modi in cui i dati del test di permeabilità Caco-2 possono essere utilizzati. In primo luogo, i composti possono essere classificati in base ai loro valori Papp. Due composti di riferimento, l’atenololo (trasporto paracellulare passivo) e il propranololo (trasporto transcellulare passivo) vengono analizzati insieme ai composti del test. L’atenololo e il propranololo hanno un assorbimento umano noto del 50% e del 90% rispettivamente2,3, e possono essere usati come marcatori per classificare i composti di prova. In secondo luogo, i dati possono essere utilizzati insieme ad altri parametri in vitro per prevedere la farmacocinetica orale di un composto in vivo utilizzando il software di simulazione Cloe PK. In terzo luogo, i dati Caco-2 possono essere usati per prevedere la permeabilità della barriera emato-encefalica (BBB) (Figura 3).
Correlazione tra Pactive derivato da Caco-2 ((PappB-A – PappA-B)/2) e il tasso di permeazione in situ della BBB, logPS (prodotto permeabilità-area superficiale). I farmaci noti per permeare la BBB (caffeina, imipramina, progesterone) hanno logPS >-2.0 (area verde ombreggiata), mentre i farmaci noti per non attraversare la BBB (aldosterone, idrocortisone, cimetidina) hanno un logPS ≤-3.5 (area rosa ombreggiata).
Viene mostrata una linea di regressione che mostra una chiara correlazione tra Pactive e logPS per i composti che non sono soggetti a livelli significativi di attività di efflusso nelle cellule Caco-2 cioè, per i composti con una Pactive di < 5 × 10 -6 cm/s. Utilizzando questa correlazione, il test Caco-2 di Cyprotex può essere utilizzato per valutare il potenziale BBB per i composti con Pactive < 5 × 10 -6 cm/s.
Qual è la relazione tra la permeabilità Caco-2 e l’assorbimento intestinale umano?
La relazione tra la permeabilità Caco-2 (utilizzando tamponi HBSS a pH7,4 in entrambi i compartimenti apicale e basolaterale) e l’assorbimento intestinale umano è visualizzata nella Figura 4. Questa correlazione è tipica di quelle osservate in letteratura per questi due parametri4. È importante notare che questo grafico è influenzato dalla precisione dei dati di assorbimento intestinale. I valori di assorbimento intestinale usati in questo grafico sono presi da Zhao et al. 20012. In questo documento l’assorbimento intestinale umano è stato estratto da varie fonti e varia considerevolmente in qualità. Diversi composti sono anche noti per mostrare un assorbimento dose-dipendente (mostrato dalle barre di errore sul grafico).
Relazione tra permeabilità Caco-2 e % di assorbimento intestinale umano.
Quali sono le differenze tra il PAMPA e il test di permeabilità Caco-2?
Lo schermo di permeabilità Caco-2 è considerato più rappresentativo dell’assorbimento umano in vivo rispetto al PAMPA (test parallelo di permeabilità della membrana artificiale). Il PAMPA fornisce solo una misura della diffusione passiva, mentre il modello Caco-2 fornisce una migliore previsione dell’assorbimento umano per i composti che mostrano l’assorbimento o l’efflusso attivo o passano attraverso la membrana attraverso la via paracellulare. Le informazioni di entrambi i saggi usati insieme possono essere preziose per identificare la causa principale di un cattivo assorbimento.
Come si misura l’efflusso dei farmaci?
Si esegue un saggio di permeabilità bi-direzionale Caco-2 in cui il trasporto del composto viene misurato nella direzione apicale a quella basolaterale e in quella basolaterale ad apicale. Il risultato è tipicamente riportato come un rapporto di efflusso, cioè Papp(B-A)/Papp(A-B). Se il rapporto di efflusso è maggiore di due, allora questo indica che si sta verificando l’efflusso del farmaco. Il talinololo, un noto substrato della P-gp, viene esaminato come composto di controllo per confermare che le cellule esprimono proteine funzionali di trasporto dell’efflusso.
Come fai a sapere se le cellule hanno formato un monostrato confluente?
La misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER) viene usata per determinare la formazione di una giunzione stretta tra le cellule. Inoltre, il giallo lucifero, un marcatore di integrità di membrana, è co-incubato con il composto di prova all’inizio dell’esperimento. Se la Papp del giallo lucifero supera 1,0 × 10 -6 cm/s in un pozzo, ma il risultato Papp derivato per il composto di prova o il composto di controllo in quel pozzo è qualitativamente simile a quello determinato nel restante pozzo replicato (entro la soglia del giallo lucifero) allora, sulla base del giudizio scientifico dello scienziato responsabile, il monostrato di cellule può essere considerato accettabile. Se questo non è il caso, allora il risultato dal monostrato interessato è escluso e un risultato n = 1 è riportato, o il composto può essere ri-testato. Se entrambi i replicati sono affetti, il composto viene nuovamente analizzato. Se entrambi i valori di Papp del giallo lucifero falliscono per lo stesso composto in due occasioni separate, allora si presume che il composto presenti effetti citotossici contro le cellule Caco-2 o una fluorescenza intrinseca.
Come e perché viene calcolata la % di recupero?
La % di recupero può essere utile nell’interpretazione dei dati Caco-2. Se il recupero è molto basso, questo può indicare problemi di scarsa solubilità, di legame del composto alla piastra, di metabolismo da parte delle cellule Caco-2 o di accumulo del composto nel monostrato cellulare.
Come si calcola il recupero %?
Leave a Reply