Significato clinico dell’espressione dei recettori cannabinoidi CB1 e CB2 nelle lesioni tiroidee umane maligne e benigne

Abstract

Il sistema endocannabinoide è composto da recettori cannabinoidi (CB1 e CB2), i loro ligandi endogeni (endocannabinoidi) e le proteine responsabili del loro metabolismo partecipano a diverse funzioni indispensabili alla regolazione omeostatica in diversi tessuti, esercitando anche effetti antitumorali. Il presente studio mira a valutare il significato clinico dell’espressione di CB1 e CB2 in lesioni tiroidee umane benigne e maligne. L’espressione delle proteine CB1 e CB2 è stata valutata immunoistochimicamente su tessuti tiroidei inclusi in paraffina ottenuti da 87 pazienti con lesioni benigne e maligne ed è stata analizzata statisticamente con parametri clinicopatologici, capacità proliferativa delle cellule follicolari e rischio di recidiva stimato secondo il sistema di stadiazione dell’American Thyroid Association (ATA). L’espressione CB1 e CB2 migliorata è stata osservata significativamente più frequentemente nelle lesioni tiroidee maligne rispetto a quelle benigne ( e , rispettivamente). Una maggiore espressione di CB1 e CB2 è stata anche osservata significativamente più frequentemente nei carcinomi papillari rispetto ai noduli iperplastici ( e , resp.). Nelle lesioni maligne della tiroide, l’espressione elevata di CB2 era significativamente associata alla presenza di metastasi linfonodali. Una maggiore espressione di CB2 è stata anche osservata più frequentemente nei casi di tiroide maligna con presenza di invasione capsulare, linfatica e vascolare, così come in quelli con un aumentato rischio di recidiva, ad un livello però non significativo, mentre l’espressione di CB1 non era associata a nessuno dei parametri clinicopatologici esaminati. I nostri dati suggeriscono che i recettori CB possono essere coinvolti nella trasformazione maligna della tiroide e specialmente il recettore CB2 potrebbe servire come utile biomarcatore e potenziale bersaglio terapeutico nella neoplasia tiroidea.

1. Introduzione

Il sistema endocannabinoide (ECS) è un sistema endogeno che induce segnali lipidici, presente in vari tessuti umani, che esercita molte funzioni diverse e non correlate. Studi sostanziali hanno indicato gli effetti regolatori dell’ECS sul sistema nervoso centrale e periferico, sul tratto gastrointestinale e sul sistema immunitario, essendo coinvolto in molteplici processi, come la motilità gastrointestinale, l’umore, la regolazione del dolore, la memoria e l’appetito. Queste funzioni sono attivate dal legame di ligandi endogeni ed esogeni ai recettori dei cannabinoidi (recettori CB). Oltre a queste funzioni ben note, l’ECS esercita anche effetti antiproliferativi attraverso la modulazione di diverse vie di segnalazione, mentre la sua attivazione può avere un significato prognostico per la progressione dello sviluppo del tumore.

Esistono due sottotipi di recettori CB, con diversa distribuzione nei tessuti umani. Il recettore CB1 si trova principalmente nel sistema nervoso centrale, negli adipociti, nel fegato, nel pancreas, nel muscolo scheletrico e nei linfociti T. Il recettore CB2 è principalmente rilevato nelle cellule immunitarie, ma anche nei neuroni e in altre cellule che compongono il sistema nervoso centrale come gli astrociti e la microglia, nonché nelle cellule endoteliali cerebromicrovascolari. L’attivazione dei recettori CB inibisce la formazione di cAMP attraverso il suo accoppiamento alle proteine Gi, con conseguente diminuzione della fosforilazione dipendente dalla protein chinasi A (PKA). I recettori CB si accoppiano anche alla chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) e in particolare a p42/p44 e p38, partecipando alla fosfatidilinositolo 3-chinasi (PI3K) e alla segnalazione della ceramide. Anche altri recettori sono legati all’ECS, come i transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV-1), i peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs), e i recettori G-protein-coupled non CB1/CB2 GPR55 .

I ligandi dell’ECS sono i cannabinoidi, compresi i componenti bioattivi della Cannabis Sativa, composti sintetici CB-mimetici, e ligandi endogeni dei recettori CB . La molecola più importante della prima categoria è il Δ9-THC, che è ben noto per i suoi tratti psicoattivi. Le altre due categorie comprendono i ligandi sintetici che sono stati attualmente sviluppati (CP55940, HU-210, HU-211, ab-cannabidiolo, acido ajulemico, WIN55,212-2) e gli endocannabinoidi che sono prodotti dal corpo umano e sono derivati lipidici messaggeri dell’acido arachidonico (AA) coniugati con etanolamina o glicerolo. Le più importanti di queste molecole sono l’anandamide (AEA) e il 2-arachidonoilglicerolo (2-AG), ma sono state identificate anche altre sostanze, come l’O-arachidonoiletanolamina (OAE, virodhamine), il 2-arachidonoilglicerolo etere (2-AGE, noladin ether), la N-arachidonoildopamina (NADA) e la palmitoiletanolamide (PEA). Oltre ai recettori CB e a tutti i loro ligandi, l’ECS comprende anche gli enzimi essenziali per la biosintesi, il trasporto e la degradazione dei ligandi.

Oltre alle funzioni dell’ECS per mantenere l’omeostasi, il già citato cross-talk tra l’ECS e le più importanti vie oncogene (MAPK/ERK e PI3K/Akt pathway) ha recentemente guadagnato interesse e ha evidenziato l’importanza dell’ECS nella tumorigenesi. Inoltre, è stato dimostrato che i cannabinoidi inducono l’apoptosi nelle cellule tumorali, inibiscono la vascolarizzazione tumorale attraverso la diminuzione del VEGF e sopprimono la capacità invasiva delle cellule tumorali. Gli effetti antiproliferativi prevalgono e diversi studi suggeriscono che i cannabinoidi hanno un potenziale come agenti antitumorali.

La diagnosi delle lesioni tiroidee è stata recentemente aumentata, non solo a causa del miglioramento delle tecniche diagnostiche, ma anche per il loro reale aumento di incidenza nella popolazione. Infatti, il carcinoma della tiroide è la neoplasia più comune del sistema endocrino. Anche se il cancro della tiroide è di solito completamente curato dalla chirurgia e dalla terapia, il 10-20% dei pazienti muore ancora per recidiva o progressione del tumore. Pertanto, è essenziale stabilire nuove strategie di trattamento e trovare nuovi marcatori prognostici al fine di prevedere il decorso clinico per ogni paziente e personalizzare di conseguenza le modalità terapeutiche disponibili. In questo aspetto, il presente studio ha mirato a valutare l’espressione immunoistochimica dei recettori CB1 e CB2 nelle lesioni tiroidee benigne e maligne in associazione con le caratteristiche clinicopatologiche relative alla prognosi.

2. Pazienti e metodi

2.1. Pazienti

Il materiale esaminato consisteva in 87 campioni chirurgici tiroidei esaminati istologicamente da un numero uguale di pazienti che erano stati sottoposti a chirurgia tiroidea per lesioni benigne e maligne. Quarantatre casi benigni (37 noduli iperplastici e 6 tiroiditi di Hashimoto) e quarantaquattro maligni (40 carcinomi papillari e 4 follicolari) sono stati inclusi nello studio. Ogni neoplasia è stata classificata secondo la classificazione istologica OMS dei tumori tiroidei. Il rischio di recidiva è stato stimato secondo il sistema di stadiazione dell’American Thyroid Association (ATA). Nessuno dei pazienti aveva ricevuto alcun tipo di trattamento antitumorale prima dell’intervento chirurgico e non vi era alcuna storia clinica di irradiazione della testa e del collo o di altri tumori.

2.2. L’immunoistochimica

Le colorazioni per CB1 e CB2 sono state eseguite su sezioni di tessuto tiroideo fissate in formalina e incluse in paraffina usando un anticorpo policlonale di capra CB1 IgG (N-15, sc-10066, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) e un anticorpo policlonale di coniglio CB2 IgG (H-60, sc-25494, Santa Cruz Biotechnology). Brevemente, sezioni di tessuto di 4 μm di spessore sono state decerate in xilene e sono state portate all’acqua attraverso alcoli graduati. Recupero dell’antigene è stata eseguita da microonde diapositive in 10 mM tampone citrato (pH 6,1) per 15 minuti (min) ad alta potenza, secondo le istruzioni del produttore. Per rimuovere l’attività endogena della perossidasi, le sezioni sono state trattate con perossido di idrogeno allo 0,3% appena preparato in metanolo al buio, per 30 minuti, a temperatura ambiente. Il legame aspecifico degli anticorpi è stato bloccato usando Eraser e Sniper, reagenti bloccanti specifici per gli anticorpi primari di capra e coniglio, rispettivamente (Biocare Medical, Concord, California, USA), per 5 minuti. Le sezioni sono state incubate per 1 ora (h), a temperatura ambiente, con gli anticorpi primari contro CB1 e CB2 diluiti 1 : 300 e 1 : 200, rispettivamente, in tampone fosfato salino (PBS) secondo le istruzioni del produttore. Le sezioni sono state poi incubate a temperatura ambiente con il reagente di collegamento biotinilato (Biocare Medical) per 10 min, seguito dall’incubazione con l’etichetta streptavidina coniugata con perossidasi (Biocare Medical) per 10 min. L’attività della perossidasi immunitaria risultante è stata sviluppata utilizzando un kit substrato DAB (Vector Laboratories, California, USA) per 10 min. Le sezioni sono state controcolorate con ematossilina di Harris e montate in Entellan (Merck, Darmstadt, Germania). Controlli negativi appropriati sono stati eseguiti omettendo l’anticorpo primario e/o sostituendolo con un antisiero irrilevante. Come controllo positivo, sono state usate sezioni di tessuto di carcinoma a cellule squamose del seno e della lingua mobile con espressione nota di CB1 e CB2. La capacità proliferativa delle cellule follicolari è stata valutata tramite l’espressione immunoistochimica Ki-67, come precedentemente descritto.

2.3. Valutazione dell’immunoistochimica

La valutazione immunoistochimica è stata eseguita contando almeno 1000 cellule tumorali in ogni caso da due osservatori indipendenti (Stamatios Theocharis e Paraskevi Alexandrou) in cieco rispetto ai dati clinici, con accordo completo dell’osservatore. I campioni sono stati considerati “positivi” per CB1 e CB2 quando più del 5% delle cellule tumorali all’interno della sezione erano colorate positivamente. L’immunoreattività delle cellule tumorali per CB1 e CB2 è stata valutata in base alla percentuale di cellule tumorali positive per CB1 e CB2 come 0: colorazione negativa – 0-4% delle cellule tumorali positive; 1: 5-24% delle cellule tumorali positive; 2: 25-49% delle cellule tumorali positive; 3: 50-100% delle cellule tumorali positive e la sua intensità come 0: colorazione negativa, 1: colorazione lieve; 2: colorazione intermedia; 3: colorazione intensa. Infine, l’espressione di CB1 e CB2 è stata classificata come bassa, se il punteggio totale era 0 o 2 e alta e se il punteggio totale era ≥3 . L’immunoreattività Ki-67 è stata classificata in base alla percentuale di cellule follicolari colorate positivamente che superava il valore percentuale mediano in due categorie (sotto e sopra il valore medio), come precedentemente riportato .

2.4. Analisi statistica

Sono stati utilizzati i test chi-quadrato per valutare la differenza di espressione di CB1 e CB2 tra lesioni tiroidee maligne e benigne, così come tra casi di carcinoma papillare e noduli iperplastici. I test chi-quadro sono stati applicati per valutare le associazioni tra l’espressione di CB1 e CB2 e le caratteristiche clinicopatologiche nel sottogruppo di pazienti con lesioni tiroidee maligne. Un test a 2 code è stato considerato statisticamente significativo. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il pacchetto software SPSS per Windows (versione 13.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

3. Risultati

3.1. Significato clinico dell’espressione di CB1 nelle lesioni tiroidee umane maligne e benigne

La positività di CB1 (punteggio IHC > 0) è stata notata in 52 (60%) su 87 lesioni tiroidee. Trentuno (36%) degli 87 casi esaminati presentavano un’alta immunoreattività di CB1 (punteggio IHC ≥ 3). Il modello subcellulare della distribuzione di CB1 era prevalentemente citoplasmatico e occasionalmente membranoso. Le aree circostanti normali adiacenti al tumore sono risultate negative per CB1. Nelle figure 1(a) e 1(b), rispettivamente, sono rappresentate le immunocolorazioni rappresentative di CB1 per il nodulo iperplastico e il carcinoma papillare. L’immunoreattività CB1 era significativamente diversa tra le lesioni tiroidee benigne e maligne (Tabella 1, ). Un’alta espressione di CB1 è stata osservata significativamente più frequentemente nel carcinoma papillare rispetto ai noduli iperplastici (Tabella 1, ). L’espressione di CB1 non era associata all’età e al sesso dei pazienti e alla capacità proliferativa delle cellule follicolari. Nel sottogruppo di lesioni tiroidee maligne, un’alta espressione di CB1 fu notata in 23 (52%) su 44 casi. Non c’era alcuna associazione tra l’espressione del recettore CB1 e le dimensioni del tumore, la presenza di invasione capsulare, vascolare o linfatica, le metastasi linfonodali e il tasso di proliferazione delle cellule follicolari (Tabella 2). L’espressione del recettore CB1 non era associata al rischio di recidiva stimato secondo il sistema di stadiazione ATA (dati non mostrati).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Figura 1

Monitoraggi CB1 rappresentativi in: (a) nodulo iperplastico e (b) carcinoma papillare. Immunostainings CB2 rappresentativi in (c) nodulo iperplastico e (d) carcinoma papillare (ingrandimento originale ×200).

3.2. Significato clinico dell’espressione di CB2 nelle lesioni tiroidee umane maligne e benigne

La positività di CB2 (punteggio IHC > 0) è stata notata in 61 (71%) su 87 lesioni tiroidee. Trentadue (37%) degli 87 casi esaminati presentavano un’alta immunoreattività di CB2 (punteggio IHC ≥ 3). Il modello subcellulare di distribuzione era prevalentemente citoplasmatico e occasionalmente membranoso. Le aree circostanti normali adiacenti al tumore sono risultate negative per CB2. Nelle figure 1(c) e 1(d) sono rappresentate, rispettivamente, le immunocolorazioni rappresentative di CB2 per i noduli iperplastici e il carcinoma papillare. Un’alta espressione di CB2 è stata osservata significativamente più frequentemente nelle lesioni tiroidee maligne rispetto a quelle benigne, così come nel carcinoma papillare rispetto ai noduli iperplastici (Tabella 1, e , rispettivamente). Nel sottogruppo di lesioni tiroidee maligne, un’alta espressione di CB2 è stata notata in 24 (55%) su 44 casi. L’alta espressione di CB2 era significativamente associata alla presenza di metastasi linfonodali (Tabella 2, ). Un’alta espressione di CB2 era anche associata alla presenza di invasione capsulare, linfatica e vascolare, ad un livello però non significativo (Tabella 2, , , e , rispettivamente). Non sono state notate associazioni tra l’espressione di CB2 e l’età e il sesso dei pazienti, le dimensioni del tumore e il tasso di proliferazione delle cellule follicolari (Tabella 2). L’alta espressione del recettore CB2 è stata osservata più frequentemente nelle lesioni tiroidee maligne che presentavano un aumento del rischio di recidiva secondo il sistema di stadiazione ATA, ad un livello non significativo però ().

4. Discussione

Nel presente studio, l’espressione delle proteine CB1 e CB2 era aumentata nelle lesioni tiroidee maligne rispetto a quelle benigne. Abbiamo anche descritto per la prima volta un’associazione tra l’espressione della proteina CB2 e i parametri clinicopatologici cruciali per la gestione e la prognosi dei pazienti. In particolare, una maggiore espressione di CB2 era significativamente associata alla presenza di metastasi linfonodali e borderline con la presenza di invasione vascolare, mentre sono state notate anche associazioni indicative ma non significative con la presenza di invasione capsulare e linfatica e il tasso di recidiva stimato. Risultati simili per la sovraespressione del recettore CB1 sono stati ottenuti, per quanto riguarda le lesioni tiroidee maligne rispetto a quelle benigne; tuttavia è stata notata un’associazione non significativa o una tendenza di correlazione tra l’espressione del CB1 e i parametri clinicopatologici.

In accordo con i presenti risultati, i recettori CB sono stati upregolati in alcuni tumori maligni umani, tra cui il carcinoma squamoso orale, il carcinoma pancreatico, epatocellulare e prostatico, mentre non erano espressi nei tessuti normali di questi organi. D’altra parte, il recettore CB1 è stato downregolato nel carcinoma colorettale in contrasto con i tessuti normali adiacenti, indicando i diversi ruoli della ECS in vari tumori e indicando le molteplici interazioni tra la ECS e i meccanismi che controllano la crescita e la proliferazione cellulare. Questi meccanismi possono includere l’induzione diretta della morte delle cellule trasformate, l’arresto del ciclo cellulare e l’inibizione dell’angiogenesi e delle metastasi tumorali. Gli effetti antitumorali di ECS sono stati rappresentati anche in numerosi studi. Nel cancro del colon-retto, gli endocannabinoidi e i cannabinoidi sintetici sono stati in grado di indurre l’apoptosi e di inibire la carcinogenesi attraverso meccanismi che coinvolgono sia i recettori CB, i canali TRPV1 e la via PPARγ. Risultati simili si sono verificati in studi condotti sul cancro al pancreas, al polmone e al seno, sul colangiocarcinoma e sul carcinoma epatocellulare. Sono stati riportati anche effetti sinergici dei cannabinoidi con la chemioterapia antitumorale convenzionale.

È stata recentemente riportata una sovraespressione del recettore CB nel carcinoma tiroideo, in vitro. Più precisamente, la stimolazione con IL-12 di linee cellulari di carcinoma tiroideo anaplastico ha indotto la sovraespressione del recettore CB2 e ha portato all’apoptosi mediata da CB2-agonisti e alla regressione del tumore. Inoltre, l’upregolazione del CB2 ha reso le cellule tumorali più suscettibili al trattamento con la chemioterapia standard. Una spiegazione putativa per questo fenomeno era l’attivazione dipendente dalla ceramide della via intrinseca mitocondriale, che porta all’apoptosi, innescata dall’attivazione del recettore CB2. Un altro studio su linee cellulari di carcinoma tiroideo ha mostrato che la 2-metil-2′-F-anandamide (Met-F-AEA) ha inibito la crescita tumorale, associata ad alti livelli di recettori CB1. L’abbondante espressione del recettore CB1 è stata notata in linee cellulari più reattive al trattamento, che successivamente erano più suscettibili all’inibizione della crescita. Tali risultati sono stati attribuiti all’attivazione di p53, all’aumento e alla diminuzione della ciclina A, portando all’apoptosi.

A parte le possibili implicazioni terapeutiche riguardanti la tumorigenesi e l’ECS, il rilevamento della sovraespressione dei recettori CB può avere un potenziale come indicatori prognostici. L’aumento di entrambi i recettori CB in campioni di tessuto di carcinoma epatocellulare è stato significativamente associato a una prognosi migliore e a una sopravvivenza libera da malattia più lunga. Tali risultati sono stati combinati con le caratteristiche istopatologiche del tumore, poiché alti livelli di recettori CB sono stati osservati nei casi che presentavano una buona differenziazione e un limitato coinvolgimento del tratto portale. D’altra parte, l’immunoreattività CB2 era associata a una sopravvivenza libera da malattia più breve nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo. Per quanto riguarda il recettore CB1, la sua sovraespressione è stata associata all’esito negativo dei pazienti nel carcinoma colorettale, prostatico e pancreatico. In particolare, una maggiore espressione di CB1 nei pazienti con carcinoma colorettale in stadio IV era indipendentemente correlata a una prognosi sfavorevole. Una maggiore espressione di CB1 è stata anche associata all’adenocarcinoma prostatico aggressivo che presenta un punteggio di Gleason più alto, dimensioni più grandi del tumore e un maggiore tasso di proliferazione cellulare, nonché metastasi alla diagnosi. Inoltre, una bassa espressione di CB1 o alti livelli di FAAH/MAGL erano correlati a un tasso di sopravvivenza più lungo e a uno stato di dolore più elevato. Risultati simili ma non statisticamente significativi per il recettore CB2 sono stati notati. Tenendo conto dei dati sopra menzionati, gli studi attualmente disponibili sui livelli dei recettori CB e le loro associazioni con la prognosi in vari tumori sembrano contraddittori e possono essere strettamente legati al grado di partecipazione dell’ECS nella tumorigenesi.

5. Conclusione

I livelli di espressione immunoistochimica dei recettori CB1 e CB2 sono stati correlati alla malignità della tiroide. Inoltre, livelli di espressione CB2 migliorati erano associati a caratteristiche clinicopatologiche importanti per la gestione terapeutica dei pazienti. Questi risultati hanno sostenuto l’evidenza che i recettori CB e specialmente il recettore CB2 possono interferire con le vie molecolari che partecipano alla trasformazione maligna della tiroide e potrebbero essere considerati come potenziali obiettivi terapeutici per sopprimere la progressione del tumore. Studi di coorte più ampi sono fortemente raccomandati al fine di confermare e stabilire l’utilità clinica dei recettori CB come potenziali marcatori prognostici nella neoplasia tiroidea.

Conflitto di interessi

Tutti gli autori confermano di non aver accettato alcun finanziamento o supporto da un’organizzazione che possa in qualche modo guadagnare o perdere finanziariamente dai risultati del presente studio. Tutti gli autori confermano di non essere stati impiegati da un’organizzazione che può in qualsiasi modo guadagnare o perdere finanziariamente dai risultati del presente studio. Nessuno degli autori ha altri conflitti di interesse.

Contributo degli autori

Eleftheria Lakiotaki e Constantinos Giaginis hanno contribuito allo studio in modo uguale.