Principio del test ELISpot

I test ELISpot utilizzano la tecnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) a sandwich. Un anticorpo monoclonale o policlonale specifico per l’analita scelto viene pre-rivestito su una micropiastra in PVDF (difluoruro di polivinilidene). Le cellule opportunamente stimolate vengono pipettate nei pozzetti e la micropiastra viene posta in un incubatore umidificato a 37 °C CO2 per un determinato periodo di tempo. Durante questo periodo di incubazione, l’anticorpo immobilizzato, nelle immediate vicinanze delle cellule che secernono, lega l’analita secreto. Dopo il lavaggio delle cellule e delle sostanze non legate, viene aggiunto ai pozzetti un anticorpo policlonale biotinilato specifico per l’analita scelto. Dopo un lavaggio per rimuovere qualsiasi anticorpo biotinilato non legato, viene aggiunta l’alcalino-fosfatasi coniugata alla streptavidina. L’enzima non legato viene successivamente rimosso mediante lavaggio e viene aggiunta una soluzione di substrato (BCIP/NBT). Si forma un precipitato di colore blu-nero che appare come macchie nei siti di localizzazione delle citochine, dove ogni singola macchia rappresenta una singola cellula secernente l’analita. Le macchie possono essere contate con un sistema di lettura ELISpot automatizzato o manualmente, usando uno stereomicroscopio.