L’importanza delle pompe di efflusso nell’antibiotico-resistenza batterica

Le pompe di efflusso sono proteine di trasporto coinvolte nell’estrusione di substrati tossici (comprese praticamente tutte le classi di antibiotici clinicamente rilevanti) dall’interno delle cellule nell’ambiente esterno. Queste proteine si trovano sia nei batteri Gram-positivi e negativi che negli organismi eucarioti.1 Le pompe possono essere specifiche per un substrato o possono trasportare una serie di composti strutturalmente dissimili (compresi gli antibiotici di più classi); tali pompe possono essere associate alla resistenza multipla ai farmaci (MDR). Nel regno procariotico esistono cinque grandi famiglie di trasportatori di efflusso:2 MF (major facilitator), MATE (multidrug and toxic efflux), RND (resistance-nodulation-division), SMR (small multidrug resistance) e ABC (ATP binding cassette). Tutti questi sistemi utilizzano la forza motrice protonica come fonte di energia,3 a parte la famiglia ABC, che utilizza l’idrolisi dell’ATP per guidare l’esportazione dei substrati. I recenti progressi nella tecnologia del DNA e l’avvento dell’era genomica hanno portato all’identificazione di numerosi nuovi membri delle suddette famiglie, e la natura ubiquitaria delle pompe di efflusso è notevole. I trasportatori che effluiscono substrati multipli, compresi gli antibiotici, non si sono evoluti in risposta agli stress dell’era antibiotica. Tutti i genomi batterici studiati contengono diverse pompe di efflusso; questo indica le loro origini ancestrali. È stato stimato che ∼5-10% di tutti i geni batterici sono coinvolti nel trasporto e una gran parte di questi codifica pompe di efflusso.2,4

C’è un certo dibattito sul ruolo fisiologico “normale” dei trasportatori di efflusso, poiché i batteri sensibili agli antibiotici e quelli resistenti portano ed esprimono questi geni. In molti casi, i geni della pompa di efflusso fanno parte di un operone, con un gene regolatore che controlla l’espressione. L’aumento dell’espressione è associato alla resistenza ai substrati, ad esempio la resistenza ai sali biliari e ad alcuni antibiotici in Escherichia coli è mediata dalla sovraespressione di acrAB.5 Anche se i geni che codificano le pompe di efflusso possono essere trovati su plasmidi, il trasporto dei geni della pompa di efflusso sul cromosoma dà al batterio un meccanismo intrinseco che permette la sopravvivenza in un ambiente ostile (ad esempio la presenza di antibiotici), e quindi i batteri mutanti che sovraesprimono i geni della pompa di efflusso possono essere selezionati senza l’acquisizione di nuovo materiale genetico. È probabile che queste pompe siano nate in modo che le sostanze nocive potessero essere trasportate fuori dal batterio, permettendo la sopravvivenza. Infatti è ormai ampiamente accettato che la “resistenza intrinseca” dei batteri Gram-negativi a certi antibiotici rispetto ai batteri Gram-positivi è il risultato dell’attività dei sistemi di efflusso.6 I sistemi di efflusso che contribuiscono alla resistenza agli antibiotici sono stati descritti da una serie di batteri clinicamente importanti, tra cui Campylobacter jejuni (CmeABC7,8), E. coli (AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, EmrB, EmrD9), Pseudomonas aeruginosa (MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-OprM9), Streptococcus pneumoniae (PmrA10), Salmonella typhimurium (AcrB11) e Staphylococcus aureus (NorA12). Tutti questi sistemi effluiscono fluorochinoloni e le pompe RND (CmeB, AcrB e le pompe Mex) esportano anche più antibiotici.

La sovraespressione delle pompe di efflusso può derivare da mutazioni nei geni repressori locali13-15 o può derivare dall’attivazione di un regolatore regolato da un regolatore trascrizionale globale come MarA o SoxS di E. coli.16,17 L’ampia gamma di substrati dei sistemi di efflusso è preoccupante, poiché spesso la sovraespressione di una pompa comporta la resistenza agli antibiotici di più di una classe, nonché ad alcuni coloranti, detergenti e disinfettanti (compresi alcuni biocidi comunemente usati). Anche la resistenza incrociata è un problema; l’esposizione a qualsiasi agente che appartiene al profilo del substrato di una pompa favorirebbe la sovraespressione di quella pompa e la conseguente resistenza incrociata a tutti gli altri substrati della pompa. Questi possono includere antibiotici clinicamente rilevanti. Un esempio di questo è visto di nuovo con il sistema mexAB di P. aeruginosa; i mutanti che producono in eccesso il MexAB sono meno suscettibili, se non completamente resistenti a una serie di antibiotici (fluorochinoloni, β-lattamici, cloramfenicolo e trimetoprim) ma anche al triclosan, un biocida comunemente usato in casa.18 Il potenziale abuso di biocidi e la possibile selezione di batteri resistenti agli antibiotici è stato recentemente discusso in questa rivista e altrove.19-22 La sovraespressione di una pompa di efflusso a resistenza multi-farmaco da sola spesso non conferisce una resistenza di alto livello e clinicamente significativa agli antibiotici. Tuttavia, tali batteri sono meglio attrezzati per sopravvivere alla pressione degli antibiotici e sviluppare ulteriori mutazioni nei geni che codificano i siti bersaglio degli antibiotici.23 È stato dimostrato che i ceppi di E. coli resistenti al fluorochinolone vengono selezionati 1000 volte più facilmente dai mutanti mar rispetto ai batteri wild-type,24 e gli E. coli altamente resistenti al fluorochinolone contengono mutazioni nei geni che codificano gli enzimi topoisomerasi bersaglio e presentano un accumulo ridotto e un maggiore efflusso (down-regulation della porina e over-expression della pompa di efflusso).14,15 Gli aumenti additivi delle MIC degli antibiotici sono stati osservati anche dopo la sovraespressione concomitante di più di una pompa di classi diverse, con conseguente E. coli altamente resistente.25

È stato dimostrato che l’espressione dei sistemi Mex di P. aeruginosa e il sistema di efflusso acrAB di E. coli è maggiore quando i batteri sono stressati, ad esempio crescita in un mezzo povero di nutrienti, crescita fino alla fase stazionaria o shock osmotico; queste condizioni inospitali possono essere rilevanti per la situazione all’interno di un’infezione.26,27 L’iperespressione non regolata delle pompe di efflusso è potenzialmente svantaggiosa per il batterio, poiché non solo i substrati tossici vengono esportati, ma anche i nutrienti e gli intermedi metabolici possono andare persi. Il lavoro con P. aeruginosa ha suggerito che i mutanti che sovraesprimono le pompe Mex sono meno capaci di resistere allo stress ambientale e sono meno virulenti delle loro controparti wild-type.28 Di conseguenza, l’espressione delle pompe è strettamente controllata. Tuttavia, i mutanti e gli isolati clinici che sovraesprimono le pompe di efflusso sono stabili e comunemente isolati; può essere che tali mutanti accumulino mutazioni compensatorie che permettono loro di crescere bene come i batteri wild-type.

Recentemente, l’uso di inibitori delle pompe di efflusso è stato studiato per migliorare e potenziare l’attività degli antibiotici esportati. Tale strategia è stata utilizzata per sviluppare inibitori che riducono l’impatto delle pompe di efflusso sull’attività del fluorochinolone. Poiché molte pompe di efflusso possiedono una significativa omologia strutturale, si spera che un composto inibitore sia attivo contro una serie di pompe di diverse specie batteriche. La maggior parte della ricerca si è concentrata sulle pompe di efflusso di P. aeruginosa Mex e sugli inibitori di queste. Uno di questi inibitori ha abbassato i valori MIC dei fluorochinoloni sia per i ceppi sensibili che per quelli resistenti.2 Inoltre, anche la frequenza di selezione dei ceppi resistenti al fluorochinolone era inferiore in presenza dell’inibitore, suggerendo che l’efflusso può essere importante nella selezione della resistenza al fluorochinolone. Osservazioni simili sono state fatte per S. pneumoniae e S. aureus.29,30 È stato anche descritto il requisito di un sistema di efflusso intatto per permettere lo sviluppo di mutazioni della topoisomerasi e la conseguente resistenza al fluorochinolone in E. coli.31 Il legame tra efflusso attivo e mutazioni nei geni che codificano le proteine del sito bersaglio suggerisce che l’uso di tali inibitori, in associazione con antibiotici substrato, può essere utile per aumentare sia l’attività che la gamma di specie per cui un farmaco può essere efficace. La progettazione di nuovi farmaci e la modifica di molecole esistenti dovrebbe ora essere effettuata tenendo presente le pompe di efflusso. Alterazioni strutturali che riducono la capacità di un antibiotico di essere effluito senza compromettere la sua attività può portare allo sviluppo di composti più potenti, certamente la ‘effluibilità’ dei farmaci deve ora essere considerato, come agenti sono sviluppati per quanto riguarda la loro efficacia complessiva e la probabilità di sviluppo di resistenza.

Per concludere, c’è una crescente evidenza che il ruolo delle pompe di efflusso nella resistenza agli antibiotici nei batteri è significativo. Anche se la resistenza di alto livello non può verificarsi come risultato di pompe di efflusso MDR da solo, l’associazione di sovraespressione di questi geni tra isolati clinici altamente resistenti non può essere ignorata. L’intrinseca resistenza agli antibiotici di alcune specie può anche essere in gran parte dovuta alle pompe di efflusso. La selezione di mutanti di efflusso da parte di biocidi incontrati nell’ambiente è una preoccupazione potenziale; è necessario un maggiore lavoro per quantificare il rischio, se esiste, da un tale processo. Gli aumenti sinergici della resistenza osservati con l’iperespressione del sistema (o dei sistemi) di efflusso e le mutazioni del sito bersaglio possono portare a batteri altamente resistenti che sono difficili da trattare. L’effetto delle pompe di efflusso deve essere considerato nella progettazione di futuri antibiotici e il ruolo degli inibitori deve essere valutato al fine di massimizzare l’efficacia degli antibiotici attuali e futuri.

Per coloro che sono interessati, ci sono una serie di eccellenti articoli di revisione incentrati sulle pompe di efflusso.2,3,9,11,32,33