Identificazione e caratterizzazione di una nuova neurotossina botulinica

La ricerca nei database genomici ha rivelato un nuovo gene BoNT

Nel tentativo di esaminare il paesaggio evolutivo dei BoNT, abbiamo eseguito ricerche iterative con modello Hidden Markov del database di sequenze Uniprot. La nostra ricerca ha identificato tutti i sottotipi noti di BoNT e le tossine a mosaico, così come la neurotossina tetanica correlata (Fig. 1a; Fig. 1 supplementare). Con nostra sorpresa, la ricerca ha rivelato un potenzialmente nuovo BoNT, designato provvisoriamente BoNT/X (Fig. 1a, GenBank no.: BAQ12790.1), dalla sequenza genomica recentemente riportata del ceppo 111 di C. botulinum. BoNT/X ha mostrato la minore identità di sequenza proteica con gli altri BoNT nei confronti a coppie (Fig. 1b). Inoltre, la bassa somiglianza di sequenza è distribuita uniformemente lungo l’intera sequenza di BoNT/X (Fig. 1c), indicando che non è una tossina a mosaico. Nonostante questa bassa identità di sequenza, la disposizione complessiva dei domini di BoNTs è conservata in BoNT/X (Fig. 1c), compreso un motivo proteasi zinco-dipendente HEXXH (residui 227-231, HELVH) nel LC (rif. 33), e un motivo SXWY nel HC (residui 1,274-1,277, SAWY), che riconosce i gangliosidi recettore lipidico34.

(a) Una rete di divisione filogenetica che copre tutti i sierotipi BoNT, sottotipi, tossine a mosaico e relativa neurotossina tetanica (TeNT) illustra le loro potenziali relazioni evolutive, nonché i conflitti derivanti ad esempio da chimerismi, sulla base delle loro sequenze proteiche. BoNT/X è evidenziato in rosso. Una versione ingrandita di questo pannello è mostrato in Fig. 1 supplementare, con il numero di accesso alla sequenza per ogni gene tossina notato. (b) Un albero filogenetico dell’allineamento della sequenza proteica per BoNT/A-G, TeNT e BoNT/X, analizzato con il metodo ClustalW. Le percentuali di identità di sequenza tra ogni tossina e BoNT/X sono annotate. (c) Pannello superiore: un disegno schematico dei tre domini di BoNT/X, con il motivo conservato della proteasi nella LC e il motivo di legame al ganglioside nella HC notato. Pannello inferiore: l’analisi utilizzando una finestra di confronto di sequenza scorrevole ha dimostrato che la bassa somiglianza tra BoNT/X e altri BoNTs/TeNT è uniformemente distribuita lungo l’intera sequenza BoNT/X. L’asse X rappresenta la posizione della sequenza di query al centro di una finestra di confronto di sequenza mobile di 100 aminoacidi. L’asse Y mostra la percentuale di identità tra quella finestra di sequenza e ciascuna delle sequenze di fondo allineate. Le due barre nella parte superiore del grafico illustrano la migliore sequenza corrispondente (barra inferiore) e se la migliore corrispondenza è significativamente separata dalla seconda migliore corrispondenza (barra superiore). (d) Un disegno schematico del cluster del gene orf che ospita il gene BoNT/X (pannello superiore), che ha due caratteristiche distinte rispetto ad altri cluster orfX noti (pannelli centrale e inferiore): (1) c’è un’ulteriore proteina orfX2 (designata orfX2b) situata accanto al gene BoNT/X; (2) il frame di lettura dei geni orfX ha la stessa direzione del gene BoNT/X.

Similmente agli altri BoNT, il gene BoNT/X è situato in un cluster genico23. Tutti e sette i BoNT stabiliti sono co-espressi con un’altra proteina di 150 kDa nota come NTNHA (proteina non tossica non emoagglutinina), che forma un complesso pH-dipendente con i BoNT e li protegge dalle proteasi nel tratto gastrointestinale35. Il gene BoNT/X è anche preceduto da un potenziale gene NTNHA (Fig. 1d). Oltre a BoNT e NTNHA, un tipico cluster di geni BoNT contiene geni che codificano uno dei due tipi di proteine accessorie: (1) il cluster HA che codifica tre proteine conservate HA17, HA33 e HA70, che formano un complesso con BoNT/NTNHA e facilitano l’assorbimento delle tossine attraverso la barriera epiteliale intestinale36,37,38; o (2) il cluster OrfX che codifica le proteine conservate OrfX1, OrfX2, OrfX3 e P47 con funzione sconosciuta23. Il gene BoNT/X si trova in un cluster di geni OrfX, così come BoNT/E, F e i membri di BoNT/A. È interessante notare che il cluster BoNT/X ha due caratteristiche uniche (Fig. 1d): (1) c’è un ulteriore gene OrfX2 che non esiste in nessun altro cluster BoNT (lo abbiamo designato OrfX2b); (2) il frame di lettura dei geni OrfX è solitamente opposto ai geni BoNT/NTNHA, ma ha la stessa direzione del gene BoNT/X nel cluster BoNT/X (Fig. 1d). Questi risultati suggeriscono che BoNT/X è un ramo unico della famiglia BoNT.

La LC di BoNT/X taglia VAMP2 in un nuovo sito

Per caratterizzare BoNT/X, ci siamo prima concentrati sulla sua LC (X-LC, residui 1-439) e l’abbiamo prodotta come proteina His6-tagged in Escherichia coli. Le LC di BoNT/A (A-LC) e BoNT/B (B-LC) sono state prodotte e testate in parallelo come controlli. Incubazione di X-LC con estratti detergenti del cervello di ratto (BDE) non ha influenzato syntaxin 1 o SNAP-25, ma abolito VAMP2 segnali immunoblot (Fig. 2a). LCs di BoNTs sono zinco-dipendente proteasi33. Come previsto, EDTA impedito scissione delle proteine SNARE da X-, A- e B-LCs (Fig. 2a). Inoltre, l’incubazione di X-LC con il dominio ricombinante purificato citosolico di VAMP2 (residui 1-93) convertito VAMP2 in due bande di peso molecolare inferiore (Fig. 2b), confermando che X-LC scinde VAMP2.

(a) X-LC è stato incubato con BDE. L’analisi dell’immunoblot è stata effettuata per rilevare la sintaxina 1, SNAP-25 e VAMP2. La sinaptofisina (Syp) è servita come controllo di carico. A-LC e B-LC sono stati analizzati in parallelo. La scissione di VAMP2 da parte di B-LC risulta nella perdita di segnali immunoblot, mentre la scissione di SNAP-25 da parte di A-LC genera un frammento più piccolo (contrassegnato da un asterisco). EDTA ha bloccato l’attività di X-, A- e B-LCs. (b) VAMP2 (1-93) è stato incubato con X-LC. I campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Blue. X-LC ha convertito VAMP2 (1-93) in due frammenti più piccoli. (c-e) VAMP2 (1-93) è stato incubato con X-LC. I campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa (LC-MS/MS) per determinare il peso molecolare dei frammenti scissi. I picchi dei peptidi eluiti dalla colonna HPLC sono tracciati sul tempo di esecuzione (RT, asse X). I dati della spettrometria di massa per i due prodotti di scissione sono codificati a colori, con il rapporto massa/carica (m/z) notato. Il peso molecolare è dedotto moltiplicando m con z, seguita dalla sottrazione di z. Le sequenze proteiche per i due prodotti di scissione sono codificati a colori ed elencati in c. (f) allineamento delle sequenze tra i membri della famiglia VAMP, con i siti di scissione per BoNT/B, D, F, G e X contrassegnati in rosso, e i due motivi SNARE in ombra blu. (g) HA-tagged VAMP1, 3, 7 e 8, e Myc-tagged Sec22b e Ykt6 sono stati espressi in cellule 293T tramite trasfezione transitoria. Lisati cellulari sono stati incubati con X-LC e sottoposti ad analisi immunoblot. L’actina è un controllo di carico. (h) GST-tagged Ykt6 è stato incubato con X-LC (100 nM). I campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione blu Coomassie. (i) GST-tagged VAMP2 (33-86), VAMP4 (1-115) e VAMP5 (1-70) sono stati incubati con X-LC (100 nM). I campioni sono stati analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione blu Coomassie. X-LC ha scisso sia VAMP4 che VAMP5. Notiamo che la proteina VAMP5 contiene una banda contaminante che corre vicino al prodotto di scissione. (j) Gli esperimenti sono stati eseguiti come descritto in a, tranne che VAMP4 e Sec22b sono stati rilevati. Synaptotagmin I (Syt I) è un controllo di carico. X-LC scisso VAMP4 nativo in BDE. Uno di due (b,g,j) o tre (a,h,i) esperimenti indipendenti è mostrato.

Per identificare il sito di scissione, abbiamo analizzato la proteina VAMP2 (1-93), con o senza pre-incubazione con X-LC, dalla cromatografia liquida-tandem spettrometria di massa (LC-MS/MS, Fig. 2c-e). Un singolo picco peptide dominante è apparso dopo l’incubazione con X-LC (Fig. 2c,e; Supplementary Fig. 2). Il suo peso molecolare è 3.081,7, che si adatta solo la sequenza peptidica di A67-L93 di VAMP2 (Fig. 2c,e). Coerentemente, un altro frammento dall’inizio della His6-tag al residuo R66 di VAMP2 è stato rilevato anche (Fig. 2d). Per confermare ulteriormente questa scoperta, abbiamo ripetuto il test con un frammento diverso VAMP2: glutatione S-transferasi (GST) taggato VAMP2 (33-86) (Fig. 3 supplementare). Incubazione con X-LC generato un singolo picco peptide dominante con un peso molecolare di 2.063,1, che si adatta solo A67-R86 di VAMP2 (Fig. 3 supplementare). Insieme, questi risultati dimostrano che X-LC ha un unico sito di scissione su VAMP2 tra R66 e A67.

R66-A67 è un nuovo sito di scissione su VAMP2, distinto da tutti i siti di destinazione stabiliti di BoNTs (Fig. 2f). E ‘anche l’unico sito di scissione BoNT situato all’interno di una regione precedentemente noto come il motivo SNARE (Fig. 2f, regioni ombreggiate) 39. La famiglia delle proteine VAMP include VAMP1, 2, 3, 4, 5, 7 e 8, così come le relative Sec22b e Ykt6. R66-A67 è conservato in VAMP1 e 3, che sono altamente omologhi a VAMP2. Per convalidare la specificità di X-LC, abbiamo espresso VAMP1, 3, 7, 8 e Sec22b e Ykt6 legate a Myc in cellule HEK293 tramite trasfezione transitoria. I lisati cellulari sono stati incubati con X-LC. Sia VAMP1 che 3 sono stati scissi dalla X-LC, mentre VAMP7, VAMP8 e Sec22b erano resistenti alla X-LC (Fig. 2g).

BoNT/X scinde VAMP4, VAMP5 e Ykt6

Inaspettatamente, anche Ykt6 è stato scisso dalla X-LC (Fig. 2g). Questo risultato è stato confermato utilizzando un frammento purificato GST-tagged Ykt6, che si è spostato in una banda di peso molecolare inferiore dopo l’incubazione con X-LC (Fig. 2h). Il sito di scissione è stato determinato per essere K173-S174 da analisi di spettrometria di massa del Ykt6 intatto contro Ykt6 scisso da X-LC (Fig. 4 supplementare). Questo sito è omologo al sito di scissione di BoNT/X su VAMP2 (Fig. 2f). Tra le proteine della famiglia VAMP, VAMP4 contiene la stessa coppia di residui (K87-S88) in questo sito come Ykt6. Abbiamo trovato che X-LC ha scisso sia il dominio citoplasmatico purificato GST-tagged di VAMP4 (Fig. 2i), sia VAMP4 nativo in BDE (Fig. 2j). Come controllo, Sec22b non è stato scisso da X-LC in BDE. Inoltre, il dominio citoplasmatico legato a GST di VAMP5 è stato anche scisso (Fig. 2i). I siti di scissione sono stati determinati dall’analisi della spettrometria di massa per essere K87-S88 in VAMP4 e R40-S41 in VAMP5 (Fig. 5 supplementare). Entrambi i siti sono omologhi al sito di scissione di BoNT/X su VAMP2 (Fig. 2f), dimostrando che la posizione del sito di scissione è conservata attraverso diverse VAMPs. La capacità di X-LC di scindere VAMP4, VAMP5 e Ykt6 è altamente insolita, poiché le loro sequenze sono sostanzialmente diverse da VAMP1/2/3. BoNT/X è il primo e l’unico BoNT conosciuto che può scindere le VAMP oltre ai bersagli canonici VAMP1, 2 e 3 (rif. 40).

Attivazione proteolitica di BoNT/X

Abbiamo poi esaminato la regione di collegamento tra la LC e la HC, che deve essere scissa dalle proteasi batteriche o dell’ospite per convertire la tossina in una forma “attiva” a catena divisa. Abbiamo prodotto un frammento ricombinante X-LC-HN (residui 1-891) in E. coli e lo abbiamo sottoposto a proteolisi limitata da endoproteinasi Lys-C. I campioni sono stati analizzati utilizzando l’etichettatura Tandem Mass Tag (TMT) e la spettrometria di massa tandem. TMT etichetta N-termini liberi (e lisine). La proteolisi limitata da Lys-C ha prodotto un nuovo termine N libero mappato al residuo N439 nella regione del linker (Fig. 3a; Dati supplementari 1), confermando che la regione del linker è suscettibile alle proteasi.

(a) Allineamento di sequenza del linker tra LC e HC dei sette BoNT stabiliti più BoNT/X. Il sito di taglio Lys-C è stato identificato dall’analisi della spettrometria di massa (vedi Metodo e Dati supplementari 1). (b) I neuroni corticali di ratto in coltura sono stati esposti a X-LC-HN per 12 ore. I lisati cellulari sono stati raccolti e l’analisi immunoblot effettuata per esaminare la sintaxina 1, SNAP-25 e VAMP2. L’actina è un controllo di carico. A-LC-HN attivato con tripsina e B-LC-HN sono stati analizzati in parallelo. X-LC-HN è entrato nei neuroni e ha scisso VAMP2. X-LC-HN attivato da Lys-C ha mostrato una maggiore potenza di X-LC-HN non attivato. X-LC-HN era più potente di B-LC-HN e A-LC-HN, nessuno dei quali ha scisso i loro substrati. (c) WT e mutanti X-LC-HN sono stati attivati da Lys-C e analizzati tramite SDS-PAGE e colorazione Coomassie Blue, con o senza DTT. C461S e C467S mutanti mostrato come una singola banda a ∼100 kDa senza DTT, e separati in due bande ∼50 kDa con DTT. Una parte di WT X-LC-HN ha formato aggregati, contrassegnati da un asterisco, che sono scomparsi con DTT. La maggior parte di WT X-LC-HN attivato si è separato in due bande di ∼50 kDa senza DTT. Ciò è dovuto a shuffling legame disolfuro come descritto nel pannello seguente. (d) Lys-C-attivato WT X-LC-HN è stato incubato con NEM per bloccare il disolfuro legame shuffling. I campioni sono stati poi analizzati mediante SDS-PAGE e colorazione blu Coomassie. Una maggioranza di WT X-LC-HN esiste come una singola banda a ∼100 kDa senza DTT dopo il trattamento NEM, indicando che nativo WT X-LC-HN contiene un legame disolfuro inter-catena. (e) Disegni schematici del legame disolfuro in WT e tre mutanti cisteina di BoNT/X. (f) Gli esperimenti sono stati eseguiti come descritto in b, tranne che i neuroni sono stati esposti a WT o X-LC-HN mutanti. La mutazione C423S ha abolito l’attività di X-LC-HN, mentre la mutazione C461 o C467 non ha influenzato l’attività di X-LC-HN. Questi risultati hanno confermato che il legame disolfuro intercatena è essenziale per l’attività di X-LC-HN, e questo legame disolfuro intercatena può essere formato attraverso C423-C461 o C423-C467. È mostrato uno di due (b) o tre (b,c,f) esperimenti indipendenti.

Abbiamo poi esaminato se l’attivazione proteolitica aumenta la potenza di BoNT/X. È stato dimostrato che l’incubazione di alte concentrazioni di LC-HN di BoNTs con neuroni coltivati risultati in ingresso di LC-HN, probabilmente attraverso l’assorbimento non specifico nei neuroni41. Allo stesso modo, X-LC-HN entrato neuroni corticali di ratto in coltura e scisso VAMP2 in modo concentrazione-dipendente (Fig. 3b). Attivazione da Lys-C aumentato la potenza di X-LC-HN: 10 nM attivato X-LC-HN scisso livelli simili di VAMP2 come 150 nM intatto X-LC-HN (Fig. 3b). Attivato X-LC-HN sembra essere più potente di attivato LC-HN di BoNT / A (A-LC-HN) e BoNT / B (B-LC-HN), che non ha mostrato alcuna scissione rilevabile dei loro substrati nelle stesse condizioni di saggio (Fig. 3b).

Il legame disolfuro intercatena in BoNT/X

Come altri BoNT, la regione del linker di BoNT/X contiene due cisteine conservate, ma c’è anche una cisteina supplementare (C461) unica per BoNT/X (Fig. 3a). Per determinare i residui di cisteina che formano l’essenziale legame disolfuro inter-catena, abbiamo generato tre mutanti X-LC-HN, ciascuno con uno dei tre residui di cisteina mutati (C423S, C461S e C467S). Questi mutanti, così come il wild-type (WT) X-LC-HN, sono stati sottoposti a proteolisi limitata con Lys-C e poi analizzati tramite SDS-PAGE e colorazione Coomassie Blue, con o senza l’agente riducente ditiotreitolo (DTT; Fig. 3c). Mutando l’unica cisteina sulla LC (C423S) ci si aspetta di abolire il legame disolfuro inter-catena. Coerentemente, il mutante C423S si è separato in due bande ∼50 kDa senza DTT. Al contrario, entrambi i mutanti C461S e C467S hanno mostrato una singola banda a 100 kDa in assenza di DTT e separati in due bande ∼50 kDa in presenza di DTT. Questi risultati hanno suggerito che C423 sulla LC può formare il legame disolfuro inter-catena con C461 o C467 sulla HC. Abbiamo anche trovato che il trattamento Lys-C ha degradato una parte significativa del mutante C423S rispetto ai mutanti C461S o C467S (Fig. 3c, +DTT), suggerendo che la perdita del legame disolfuro intercatena rende la molecola più suscettibile alle proteasi. Abbiamo notato che una parte di WT X-LC-HN formato aggregati nella parte superiore del gel SDS-PAGE (Fig. 3c, contrassegnati da un asterisco). Questi aggregati sono scomparsi in presenza di DTT. C423/C461/C467 sono le uniche tre cisteine nel X-LC-HN; la mutazione di una qualsiasi di esse ha abolito la formazione di aggregati (Fig. 3c, -DTT), suggerendo che questi aggregati sono formati da legami disolfuro intermolecolari dovuti all’esistenza di una cisteina in più nella regione del linker.

Interessante, la maggior parte di WT X-LC-HN attivato separato in due bande ∼50 kDa senza DTT (Fig. 3c), che è simile a C423S mutante. D’altra parte, WT X-LC-HN non ha mostrato un aumento della degradazione da Lys-C rispetto al mutante C423S (Fig. 3c, +DTT). Una possibile spiegazione è che WT X-LC-HN contiene un legame disolfuro inter-catena in condizioni native, ma questo legame può riarrangiare alla coppia intra-catena C461-C467 in condizioni denaturanti nel buffer SDS. Questo fenomeno è noto come shuffling del legame disolfuro, che spesso si verifica tra cisteine adiacenti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo utilizzato un reagente alchilante, N-Ethylmaleimide (NEM), che blocca in modo permanente cisteine libere e impedisce shuffling legame disolfuro. Come mostrato in Fig. 3d, WT X-LC-HN pretrattato con NEM ha mostrato come una singola banda a 100 kDa in assenza di DTT, e separati in due bande ∼50 kDa in presenza di DTT. Questi risultati confermano che WT X-LC-HN contiene principalmente un legame disolfuro inter-catena, ma è suscettibile al rimescolamento del legame disolfuro a causa di una cisteina extra nella regione del linker (Fig. 3e).

Abbiamo ulteriormente esaminato l’attività dei tre mutanti cisteina X-LC-HN su neuroni in coltura. Come previsto, il mutante C423S era inattivo, mentre i mutanti C461S e C467S hanno entrambi mostrato livelli simili di attività come WT X-LC-HN (Fig. 3f). Questi risultati confermano che il legame disolfuro intercatena è fondamentale per l’attività di BoNT/X.

Generazione di BoNT/X a lunghezza intera tramite legatura mediata da sortasi

Abbiamo quindi cercato di determinare se BoNT/X a lunghezza intera è una tossina funzionale. Poiché non sono disponibili antisieri contro BoNT/X, abbiamo deciso di evitare di generare il gene della tossina attiva a lunghezza intera. Invece, abbiamo sviluppato un approccio per generare una quantità limitata di BoNT completo in provetta tramite legatura enzimatica di due frammenti non tossici di BoNT. Questo metodo utilizza una transpeptidasi nota come sortase42,43, che riconosce il motivo peptidico LPXTG, taglia tra T-G, e contemporaneamente forma un nuovo legame peptidico con altre proteine/peptidi contenenti glicina N-terminale (Fig. 4a). Abbiamo prodotto due frammenti non tossici di BoNT/X: (1) LC-HN con un motivo LPETGG e un tag His6 fuso al termine C, e (2) l’HC di BoNT/X (X-HC) con un tag GST, sito di scissione della trombina, e un residuo di glicina supplementare al suo termine N. Il taglio da parte della trombina rilascia X-HC con una glicina libera al suo terminale N. Incubazione di questi due frammenti con sortasi generato una piccola quantità di ∼150 kD full-length BoNT / X (X-FL, Fig. 4a,b). Notiamo che X-HC ha mostrato scarsa solubilità e una forte tendenza verso l’aggregazione, che potrebbe essere la ragione per la bassa efficienza di legatura (Fig. 4b). Al contrario, la legatura di X-LC-HN con l’HC di BoNT / A (A-HC) raggiunto una migliore efficienza, con la maggior parte di X-LC-HN legato in una tossina chimerica XA (Fig. 6a supplementare). Per garantire la biosicurezza, la quantità di frammenti precursori nella reazione è strettamente limitato a generare la quantità minima di tossina legato necessario per saggi funzionali.

(a) Un disegno schematico del metodo di legatura sortase. (b) Le miscele di reazione di legatura della sortasi sono state analizzate mediante SDS-PAGE e colorazione con Coomassie Blue. L’asterisco segna gli aggregati proteici dovuti ai legami disolfuro intermolecolari. Full-length BoNT/X (X-FL) è apparso solo nella miscela di legatura sortase. (C) Neuroni esposti alla miscela di legatura sortase (15 microlitri) o miscele di controllo per 12 h in terreno di coltura. Lisati cellulari sono stati analizzati da immunoblot. La miscela contenente sia X-LC-HN e X-HC (ma non sortase) scisso leggermente più VAMP2 di X-LC-HN da solo. Ligating X-LC-HN e X-HC da sortase ulteriormente migliorato scissione di VAMP2, dimostrando che legato X-FL è funzionale sui neuroni. (d) BoNT/A-G, BoNT/DC e BoNT/X sono stati sottoposti al saggio dot blot, utilizzando quattro antisieri di cavallo (trivalente anti-BoNT/A, B ed E, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC e anti-BoNT/F), così come due antisieri di capra (anti-BoNT/G e anti-BoNT/D). BoNT/X è composto da X-LC-HN e X-HC in rapporto molare 1:1. Questi antisieri hanno riconosciuto le loro corrispondenti tossine target, ma nessuno ha riconosciuto BoNT/X. Gli antisieri contro BoNT/DC e BoNT/C reagiscono in modo incrociato, poiché queste due tossine condividono un alto grado di somiglianza all’interno dei loro domini HC. (e) I neuroni corticali di ratto in coltura sono stati esposti a X-FL legato in terreno di coltura per 12 ore, con o senza due combinazioni di antisieri. Ab1: trivalente anti-BoNT/A/B/E, anti-BoNT/C e anti-BoNT/F. Ab2: anti-BoNT/G e anti-BoNT/D. L’anti-BoNT/A/B/E trivalente è stato usato alla diluizione 1:50. Tutti gli altri antisieri sono stati usati alla diluizione 1:100. Nessuno degli antisieri ha influenzato la scissione di VAMP2 e VAMP4 da parte di X-FL. La specificità e la potenza di questi antisieri sono stati convalidati per la loro capacità di neutralizzare i sierotipi bersaglio nello stesso saggio come descritto nella Fig. 7 supplementare. (f) X-FL collegato da reazione sortasi (0,5 μg) è stato iniettato nei muscoli gastrocnemio dell’arto posteriore destro dei topi (n = 4). L’arto iniettato sviluppato tipica paralisi flaccida, e le dita dei piedi non è riuscito a diffondere entro 12 h. L’arto sinistro non è stato iniettato con le tossine, che serve come controllo. (G) Full-length forma inattiva di BoNT / X (BoNT / XRY) è stato purificato come un His6-tagged proteina ricombinante in E. coli. Ulteriore purificato BoNT/XRY è mostrato in Fig. 8b supplementare. Uno di due (e) o tre (c, d) esperimenti indipendenti è mostrato.

Abbiamo prima analizzato l’attività di BoNT/X legato utilizzando neuroni corticali di ratto in coltura. I neuroni sono stati esposti alla miscela di legatura della sortasi e alle miscele di controllo nel terreno di coltura. Come mostrato in Fig. 4c, X-LC-HN solo scisso alcuni VAMP2 a causa della sua alta concentrazione nella miscela di reazione. Miscelazione X-HC con X-LC-HN senza sortase leggermente migliorato scissione di VAMP2 rispetto alla X-LC-HN da solo, suggerendo che X-HC potrebbe essere associato con X-LC-HN attraverso interazioni non covalenti. Questa interazione sembra essere specifico, come mescolare A-HC con X-LC-HN non ha migliorato la scissione di VAMP2 nei neuroni (Fig. 6b supplementare). Ligating X-LC-HN con X-HC da sortase chiaramente migliorato scissione di VAMP2 rispetto alla miscela di X-LC-HN e X-HC senza sortase (Fig. 4c). Questi risultati hanno dimostrato che la X-HC è funzionale per le cellule di targeting e che legato full-length BoNT/X entrato neuroni e scisso VAMP2. Allo stesso modo, anche XA legato è entrato nei neuroni e ha scisso VAMP2 (Fig. 6b).

BoNT/X non è stato riconosciuto da antisieri contro BoNT noti

Abbiamo poi effettuato test dot blot utilizzando antisieri sollevati contro BoNT noti, compresi tutti i sette sierotipi e una tossina mosaico (BoNT/DC), per confermare che BoNT/X è sierologicamente unico. Sono stati utilizzati quattro antisieri di cavallo (anti-BoNT/A, B ed E trivalenti, anti-BoNT/C, anti-BoNT/DC e anti-BoNT/F) e due antisieri di capra (anti-BoNT/G e anti-BoNT/D). La specificità e la potenza di questi antisieri sono state prima convalidate analizzando la loro capacità di neutralizzare i BoNT sui neuroni in coltura. Come previsto, tutti gli antisieri hanno neutralizzato i loro BoNT bersaglio, senza influenzare l’attività di un sierotipo diverso (Fig. 7 supplementare). Abbiamo trovato che questi antisieri riconosciuto i loro BoNT corrispondenti nel saggio dot blot, ma nessuno riconosciuto BoNT/X (Fig. 4d).

Abbiamo ulteriormente analizzato se la tossicità di BoNT/X sui neuroni può essere neutralizzato da questi antisieri. X-FL generato dalla legatura mediata dalla sortasi è stato prima attivato con proteolisi limitata usando la tripsina. Abbiamo usato la tripsina per attivare X-FL invece di Lys-C per i saggi funzionali, come tripsina ci permette di fermare la proteolisi utilizzando inibitori della tripsina. Attivato X-FL entrato neuroni corticali di ratto in coltura e scisso sia VAMP2 e VAMP4 in modo concentrazione-dipendente (Fig. 4e). Combinazioni di antisieri contro noti BoNTs (Ab1 (cavallo antisieri): trivalente anti-BoNT / A, B e E, anti-BoNT / C, e anti-BoNT / F; Ab2 (capra antisieri): anti-BoNT / G e anti-BoNT / D) non ha influenzato l’attività di legato X-FL, come evidenziato da gradi simili di VAMP2 e VAMP4 scissione in presenza di questi sieri (Fig. 4e). Questi risultati hanno confermato che BoNT/X è un nuovo sierotipo BoNT.

BoNT/X ha indotto paralisi flaccida in vivo nei topi

Abbiamo poi cercato di determinare se BoNT/X è attivo in vivo utilizzando un ben noto saggio non letale nei topi, noto come il Digit Abduction Score (DAS) saggio, che misura la paralisi muscolare locale dopo l’iniezione di BoNTs nei muscoli degli arti posteriori del mouse44. BoNTs causare paralisi flaccida dei muscoli degli arti, che si manifesta come il fallimento di diffondere le dita dei piedi in risposta ad uno stimolo di startle. Abbiamo iniettato legato X-FL (0,5 μg, attivato dal trattamento tripsina) nei muscoli gastrocnemio dell’arto posteriore destro nei topi, che ha indotto tipica paralisi flaccida e il fallimento delle dita dei piedi per diffondere (Fig. 4f), indicando che BoNT / X è in grado di causare paralisi flaccida in vivo. Notiamo che la potenza di X-FL legato sembra essere molto più basso di altri BoNT in questo saggio. Per confermare ulteriormente la bassa tossicità del X-FL legato, abbiamo iniettato topi con 1 μg di X-FL legato per via intraperitoneale (n=3). Nessun topo ha mostrato effetti sistemici e tutti sono sopravvissuti a questa dose. Così, X-FL legato ha una tossicità piuttosto bassa in vivo nei topi rispetto ad altri BoNT nativi, che di solito hanno dosi letali a bassi livelli di picogrammi per topo.

BoNT/X inattivo a lunghezza intera

Infine, abbiamo sviluppato un mutante inattivo di BoNT/X come potenziale reagente per generare anticorpi neutralizzanti. Le mutazioni a due residui (R362A/Y365F) in BoNT/A inattivano l’attività proteasica del LC e aboliscono la tossicità di BoNT/A in vivo45,46. Questi due residui sono conservati in BoNT/X. Abbiamo introdotto le mutazioni corrispondenti (R360A/Y363F) in BoNT/X e generato un full-length forma inattiva, designato come BoNT/XRY. Come mostrato in Fig. 4g, BoNT/XRY è stato purificato come una proteina His6-tagged in E. coli, e non aveva attività sui neuroni in coltura (Fig. 8a supplementare). Inoltre, l’iniezione intraperitoneale di topi con 30 μg BoNT/XRY (attivato dal trattamento tripsina) non ha causato alcun effetto negativo (n = 5), dimostrando che non è tossico in vivo. Una parte sostanziale di BoNT/XRY formato aggregati nella parte superiore del gel SDS-PAGE (Fig. 4g). L’aggiunta di DTT ha ridotto questi aggregati a BoNT/XRY monomerico (Fig. 4g). Così, la lunghezza completa BoNT/X è suscettibile di formare legami disolfuro inter-molecolari. Tuttavia, la forma monomerica di BoNT / X può essere purificato ed è stabile in soluzione (Fig. 4g). Inoltre, abbiamo sviluppato un protocollo di purificazione scale-up, che ha generato BoNT / XRY con un rendimento di ∼3 mg per litro di cultura e ∼90% di purezza (Fig. 8b supplementare). BoNT/XRY altamente purificato è rimasto stabile in soluzione fino a 10 mg ml-1 in presenza di agente riducente. Questo BoNT/XRY atossico sarà un prezioso reagente per la generazione di anticorpi neutralizzanti.