Articles / Settembre 24, 2021

I criteri istomorfologici del midollo osseo possono diagnosticare accuratamente la linfoistiocitosi emofagocitica

La linfoistiocitosi emofagocitica (HLH) è una rara malattia infiammatoria multi-sistema con criteri diagnostici basati sullo studio HLH-2004. L’emofagocitosi è l’unico criterio istomorfologico, ma da solo non è né specifico né sensibile per la diagnosi di HLH. Mentre sono state stabilite soglie oggettive per i criteri clinici e di laboratorio, i criteri specifici per l’evidenza istomorfologica dell’emofagocitosi nella HLH non sono stati rigorosamente valutati o stabiliti. Abbiamo cercato di determinare se i criteri numerici e oggettivi per l’emofagocitosi morfologica potrebbero essere identificati, e se tali criteri aiuterebbero nella diagnosi di HLH. Abbiamo analizzato le caratteristiche morfologiche dell’emofagocitosi in 78 pazienti che presentavano caratteristiche cliniche sospette per HLH: 40 pazienti con e 38 pazienti senza HLH. Abbiamo dimostrato che l’eritrofagocitosi non nucleata da sola è un reperto aspecifico, mentre l’emofagocitosi di granulociti, eritrociti nucleati (4 per 1000 cellule, AUC: 0.92, 95%CI: 0.87, 0.98), e almeno un emofagocita contenente più cellule nucleate (AUC: 0.91, 95%CI: 0.85, 0.95) sono fortemente associati a HLH. La modellazione congiunta di emofagociti contenenti granulociti inglobati, eritrociti nucleati e linfociti distingue efficacemente tra HLH e non-HLH (AUC cross-validata: 0,90, 95%CI: 0,83, 0,97).

Introduzione

La linfoistiocitosi emofagocitica (HLH) è una rara sindrome pericolosa per la vita che si verifica come conseguenza di una grave attivazione immunitaria sistemica.1 La proliferazione delle cellule T citotossiche porta ad un aumento della produzione di citochine e all’attivazione dei macrofagi residenti nei tessuti. In ultima analisi, il danno multi-sistema degli organi finali causato dall’infiammazione massiva può portare ad un esito fatale senza una diagnosi tempestiva e l’inizio di una terapia appropriata.2

La linfoistiocitosi emofagocitica colpisce pazienti di tutte le età e si verifica come una malattia ereditaria, o secondariamente nel contesto di condizioni predisponenti che alterano la normale risposta immunitaria. La forma ereditaria della malattia si presenta nella prima infanzia ed è associata a mutazioni omozigoti nei geni coinvolti nell’immunità mediata dalle cellule T CD8 e NK.3 Queste forme genetiche di HLH sono uniformemente fatali senza trapianto di cellule ematopoietiche o terapia genica. La HLH secondaria può verificarsi sporadicamente in individui sani, ma è più spesso riscontrata in pazienti con tumori ematologici maligni, malattie autoimmuni e immunosoppressione iatrogena. Si pensa che praticamente tutti i casi richiedano un fattore scatenante infettivo o non infettivo per iniziare la risposta immunitaria aberrante, indipendentemente dalla disfunzione immunitaria sottostante.74

La linfoistiocitosi emofagocitica si presenta bruscamente in un periodo di diversi giorni o settimane con un modello coerente di febbre, pancitopenia e splenomegalia. Anomalie di laboratorio comuni includono iperferritinemia, ipofibrinogenemia, ipertrigliceridemia, recettore IL-2 solubile elevato e test di funzionalità epatica anormali.1 I criteri diagnostici più usati per la HLH sono stati sviluppati per l’inclusione nel trial HLH-2004 che richiede l’evidenza genetica di una mutazione associata alla HLH o il soddisfacimento di 5 degli 8 criteri clinici tra cui febbre, splenomegalia, bicytopenia, ipertrigliceridemia o ipofibrinogenemia, evidenza di emofagocitosi nel midollo osseo o altri tessuti, bassa o assente attività delle cellule NK, ferritina elevata e recettore IL-2 solubile elevato.3 Sebbene non siano stati convalidati per gli adulti, questi criteri HLH-2004 sono ampiamente applicati in pazienti di tutte le età.

I patologi svolgono un ruolo fondamentale nel workup diagnostico dei pazienti con sospetto di HLH. L’esame del midollo osseo viene eseguito per valutare l’emofagocitosi, identificare la malignità sottostante ed escludere i mimici benigni o neoplastici. La presenza di emofagocitosi nel midollo soddisfa uno dei criteri diagnostici della HLH-2004; tuttavia, non è stata stabilita una soglia diagnostica accettata o linee guida di segnalazione. La mancanza di linee guida basate sull’evidenza porta ad una considerevole incertezza tra i patologi su quale grado di emofagocitosi sia sufficiente a soddisfare questo criterio. La sfida si aggiunge al fatto che l’emofagocitosi non è specifica per la diagnosi di HLH in assenza di altre caratteristiche cliniche della malattia. Una rara eritrofagocitosi è comunemente osservata negli aspirati di midollo osseo e un aumento dell’emofagocitosi può essere riscontrato in caso di sepsi, trasfusioni di sangue, trapianto ematopoietico, chemioterapia e sindrome mielodisplastica.118

Data la mancanza di una soglia definita per soddisfare il criterio per la diagnosi di HLH, abbiamo progettato questo studio retrospettivo per interrogare se le caratteristiche morfologiche quantitative o qualitative dell’emofagocitosi negli aspirati midollari sono predittive della diagnosi finale di HLH. Abbiamo identificato una coorte di pazienti che presentavano caratteristiche cliniche preoccupanti per HLH e i loro aspirati sono stati esaminati in cieco.

Gli emofagociti sono stati enumerati per 1000 cellule nucleate secondo il lineage del loro contenuto ematopoietico ingerito (Figura 1). Oltre alle caratteristiche quantitative, abbiamo valutato una caratteristica morfologica binaria, la presenza di più cellule nucleate all’interno di un singolo emofagocita, come possibile caratteristica predittiva di HLH.

Metodi

Selezione dei pazienti

Abbiamo cercato nel database del Laboratory Information Service di patologia (Powerpath) usando le seguenti parole chiave: “linfoistiocitosi emofagocitica”, “emofagocitosi”, “eritrofagocitosi”, e “HLH”. Questa ricerca ha restituito 258 risultati tra le date 1 gennaio 2013 e 7 gennaio 2017, e ha incluso il testo da qualsiasi punto all’interno del rapporto diagnostico comprese le informazioni cliniche fornite, la descrizione microscopica, la linea diagnostica, e/o il commento diagnostico (Figura 2). Le cartelle cliniche di questi pazienti sono state esaminate da EG per valutare se il sospetto clinico per HLH era presente al momento dell’aspirazione del midollo osseo, indicato sul modulo di richiesta del campione (cioè “escludere HLH” o “preoccupazione per HLH”) o elencato nella diagnosi differenziale nella cartella clinica elettronica (EMR) entro una settimana prima della biopsia. Informazioni demografiche, caratteristiche cliniche, impressioni diagnostiche, caratteristiche patologiche e valori di laboratorio al momento della biopsia sono stati raccolti per ogni paziente. I pazienti sono stati classificati come “HLH” e “non-HLH” in base all’impressione diagnostica degli ematologi consulenti descritta nelle note cliniche. La diagnosi finale in tutti i casi è stata determinata sulla base dei criteri HLH-2004 insieme al quadro clinico complessivo. I pazienti sono stati esclusi dall’analisi se l’emofagocitosi è stata notata incidentalmente indipendentemente dalla preoccupazione clinica per HLH, i vetrini non erano disponibili per la revisione, HLH è stato considerato ma la diagnosi era equivoca dopo il workup, o una storia documentata di HLH-diretto trattamento è stato notato prima della biopsia. Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Stanford University.

Valutazione degli aspirati midollari

Gli aspirati midollari (colorati con Wright-Giemsa) di pazienti HLH e non HLH sono stati valutati in cieco. Ogni vetrino di aspirato è stato inizialmente esaminato a bassa potenza (4x) per identificare le aree con emofagocitosi e selezionare un vetrino appropriato per enumerare gli emofagociti. Duecentocinquanta cellule nucleate intatte sono state contate in ogni quadrante su un singolo aspirato per caso nelle aree con la più alta densità di emofagociti. Gli istiociti sono stati contati in base al lignaggio delle cellule ingerite (RBC maturi, nRBCS, granulociti e linfociti) e la somma delle cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) è stata calcolata come il numero totale di istiociti contenenti cellule ematopoietiche ingerite. La presenza di più cellule nucleate in un singolo emofagocita è stata anche annotata.

I metodi utilizzati per l’analisi statistica sono descritti nell’Appendice supplementare online.

Risultati

Caratteristiche dei pazienti

Le caratteristiche dei pazienti di 40 pazienti con HLH e 38 pazienti senza HLH sono riassunte nella tabella 1. Non ci sono state differenze significative per quanto riguarda l’età o il sesso. I pazienti con HLH avevano più probabilità di presentare una malignità sottostante rispetto al gruppo non HLH (56% vs. 24%; P<0.05), con il linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) come diagnosi primaria più comune tra i pazienti con HLH (Tabelle 1 e 2). Il virus di Epstein-Barr (EBV) è stato il fattore infettivo più comunemente identificato nei pazienti con HLH; il 32,5% dei pazienti nel gruppo HLH aveva evidenza di infezione da EBV mediante rilevazione PCR del sangue periferico o immunoistochimica rispetto al 10.5% nel gruppo non-HLH (P<0,01).

Come previsto, i pazienti con diagnosi di HLH avevano una maggiore probabilità di presentare risultati clinici e di laboratorio che soddisfano ciascuno dei criteri diagnostici HLH-2004 (Tabella 1). Sono state osservate differenze significative tra i gruppi HLH e non-HLH nel valore medio di ogni test di laboratorio (trigliceridi, fibrinogeno, ferritina e IL-2r solubile) e il numero di pazienti che soddisfano ogni singolo criterio HLH-2004, ad eccezione della funzione delle cellule natural killer (NK). Anche se il test della funzione delle cellule NK compromessa o assente è considerato un valido strumento di screening per i pazienti con difetti genetici nella citotossicità, questo test è raramente ordinato negli adulti con HLH secondaria e ha un alto tasso di fallimento, limitando la sua utilità diagnostica.

L’emofagocitosi è stata riportata nel rapporto diagnostico del midollo osseo di tutti i 40 pazienti con HLH, rispetto a 12 su 38 (32%) nel gruppo non-HLH (P<0.01). Anche se l’evidenza dell’emofagocitosi può essere rassicurante per i medici nel fare la diagnosi di HLH, l’emofagocitosi non è necessaria. Nella nostra coorte, la maggior parte dei pazienti con diagnosi finale di HLH (73%) soddisfaceva 5 o più criteri indipendentemente dall’evidenza di emofagocitosi nell’aspirato midollare (Tabella 1). Tuttavia, 9 pazienti (23%) nel gruppo HLH e 8 pazienti (21%) nel gruppo non-HLH hanno soddisfatto 4 criteri escludendo l’emofagocitosi, indicando che la valutazione morfologica dell’aspirato midollare era fondamentale per la diagnosi nel 22% dei pazienti che presentavano caratteristiche cliniche preoccupanti per HLH.

Due pazienti nel gruppo HLH soddisfacevano meno di 5 dei criteri HLH-2004; tuttavia, entrambi questi pazienti erano chirurgicamente asplenici e il resto dei loro risultati clinici e di laboratorio, compresa la presenza di emofagocitosi su aspirato midollare, erano compatibili con la diagnosi. Quattro pazienti nel gruppo non-HLH hanno soddisfatto 5 criteri ma non sono stati diagnosticati con HLH. Le note cliniche dei medici curanti indicano che la cronicità dei sintomi era considerata incompatibile con la HLH. Nessuno di questi pazienti aveva emofagocitosi identificata nel loro midollo osseo.

Sviluppo di modelli predittivi per una diagnosi morfologica di linfoistiocitosi emofagocitica

I pazienti con diagnosi di HLH (n=40) hanno mostrato valori significativamente più alti di emofagociti totali, ed emofagociti con qualsiasi lineamento cellulare (RBC, nRBC, granulociti e linfociti) rispetto ai pazienti non HLH (n=38) (P<0.001 per tutti i lignaggi) (Figure 1 e 3). L’analisi di correlazione ha dimostrato che ciascuno dei criteri clinici e di laboratorio inclusi nei criteri HLH-2004 (esclusa la funzione NK) ha una significativa correlazione positiva con il numero totale di emofagociti ed emofagociti con ciascuna delle singole linee cellulari, indicando che il grado di emofagocitosi è correlato alla diagnosi di HLH (Figura supplementare online S1).

Indipendentemente l’uno dall’altro, ogni lineage distingueva abbastanza bene tra HLH e non-HLH. I nRBC ingeriti e i granulociti ingeriti hanno avuto la più alta area sotto la curva (AUC), indicando un alto grado di classificazione corretta dei soggetti HLH e non-HLH (AUC: 0,92), con valori soglia di 2 cellule ingerite e 1 cellula ingerita, rispettivamente. La somma di tutti e quattro i lignaggi anche eseguito bene a distinguere tra HLH e non-HLH con un valore di soglia di 6 (AUC: 0.92, 95%CI: 0.85, 0.98).

Dicotomizzando ogni lignaggio basato sui valori di soglia descritti sopra e includendo tutti e quattro in un albero di decisione, emofagociti ingerire granulociti è stato scelto come il più importante predittore di HLH, seguita da nRBCs e linfociti (Figura 4A). I pazienti con assenza di emofagociti che ingeriscono granulociti avevano il 3% di probabilità di avere una diagnosi di HLH. I pazienti con una presenza di almeno un emofagocita con un granulocita ingerito, due o più emofagociti con nRBC ingeriti e un emofagocita con linfociti ingeriti insieme erano garantiti per avere una diagnosi di HLH (100% di probabilità). Cross-validato (CV) AUC di questo CART era 0.90; 95%CI: 0.83-0.97.

Identificare i linfociti nelle HPC è raro, anche in presenza di HLH florida. Il numero più alto di HPC contenenti linfociti è stato identificato in un paziente con DLBCL e, in base alla morfologia, rappresentava probabilmente cellule tumorali ingerite. Inoltre, distinguere tra eritrociti nucleati, linfociti e cellule progenitrici ematopoietiche nel citoplasma di un istiocita è difficile e soggetto a variabilità interpretativa. Come tale, abbiamo creato un’ulteriore CART escludendo i linfociti. Questa CART è identica ai primi due livelli del modello precedente, con i pazienti che hanno una probabilità del 92% di avere una diagnosi di HLH con una presenza di almeno un emofagocita con un granulocita ingerito e due o più emofagociti con nRBC ingeriti (Figura 4B). Mentre l’AUC CV era identico a quello del primo, l’accuratezza complessiva era leggermente superiore nella CART senza linfociti (88% di accuratezza CV vs. 86%).

Valutazione quantitativa

La descrizione iniziale della sindrome emofagocitica associata al virus descriveva istiociti che erano “pieni” di elementi ematopoietici ingeriti.11 Noi osserviamo frequentemente il fenomeno delle cellule nucleate multiple all’interno dei singoli istiociti nei pazienti con HLH consolidata e abbiamo ipotizzato che questo risultato possa essere indicativo di uno stato emofagocitico patologico. Per valutare il significato del grado di emofagocitosi all’interno dei singoli emofagociti, abbiamo analizzato la presenza di cellule nucleate multiple all’interno degli istiociti (Figura 1). La nostra analisi ha infine dimostrato che almeno un emofagocita contenente cellule nucleate multiple è stato identificato in 37 pazienti con HLH rispetto a solo 4 pazienti nel gruppo non-HLH (AUC: 0,91, 0,845-0,947), indicando che questa caratteristica qualitativa binaria funziona in modo simile alla metrica quantitativa descritta sopra per distinguere i pazienti con HLH dai pazienti non-HLH (Tabella 3).

Discussione

Data la rarità della diagnosi e la presentazione clinica aspecifica, HLH è una diagnosi impegnativa per clinici e patologi. Una volta considerata nella differenziale, il workup rapido che include la valutazione di ciascuno dei criteri HLH-2004 è comunemente perseguito, poiché l’intervento terapeutico precoce migliora gli esiti in questi pazienti spesso gravemente malati. Sfortunatamente, non esiste una soglia definita per soddisfare il criterio diagnostico dell’emofagocitosi nel midollo osseo e non sono state stabilite linee guida basate sull’evidenza per riportare i risultati.

Per raggiungere questo obiettivo, abbiamo progettato questo studio retrospettivo per determinare se le caratteristiche quantitative dell’emofagocitosi al momento della valutazione iniziale del midollo osseo sono predittive della diagnosi finale di HLH in pazienti che presentano caratteristiche cliniche riguardanti la diagnosi. Dato che la HLH si presenta classicamente con citopenia multilineare che si pensa derivi dal consumo di cellule ematopoietiche da parte dei macrofagi attivati,12 abbiamo sospettato che i pazienti con HLH avrebbero avuto maggiori probabilità di mostrare l’emofagocitosi di eritrociti nucleati, granulociti e linfociti rispetto ai pazienti senza HLH. Oltre a valutare le possibili differenze quantitative nell’emofagocitosi, abbiamo valutato simultaneamente la presenza di più cellule nucleate all’interno di un singolo emofagocita come caratteristica morfologica binaria candidata che può differenziare i pazienti con emofagocitosi patologica.

In generale, abbiamo trovato che i pazienti con HLH hanno mostrato un numero significativamente più alto di HPCs per ciascuna delle stirpi esaminate (Tabella 3). Abbiamo anche identificato i thresh olds quantitativi che possono essere utilizzati per diagnosticare accuratamente la maggior parte dei casi di HLH: un granulocita o due cellule eritroidi nucleate per 1000 cellule nucleate. Inoltre, abbiamo utilizzato l’analisi ad albero di classificazione e regressione per identificare la migliore combinazione di variabili per creare un modello ancora più specifico e predittivo per discriminare i pazienti con HLH. Infine, abbiamo dimostrato che la presenza di più cellule nucleate all’interno di un singolo emofagocita era ulteriormente predittiva di una diagnosi di HLH tra i pazienti che si presentavano con risultati clinici preoccupanti per la malattia.

La descrizione iniziale della sindrome emofagocitica associata al virus (VAHS) ha descritto un’emofagocitosi florida in 19 casi di pazienti immunodepressi e precedentemente sani che presentavano caratteristiche cliniche compatibili con HLH.11 In 60 aspirati midollari consecutivi utilizzati per il confronto, hanno trovato eritrofagocitosi in 29 casi su 60; tuttavia, il grado di fagocitosi non era “mai di un grado tale da essere confuso con la VAHS”. Questo studio condotto prima dello sviluppo dei criteri HLH-2004 ha fornito la prova iniziale dell’associazione dell’emofagocitosi con la VAHS (ciò che oggi chiameremmo HLH), e ha dimostrato che il riscontro di eritrofagocitosi è frequentemente identificato in aspirati midollari di pazienti senza HLH, dimostrando una mancanza di specificità in isolamento dei risultati clinici.

Abbiamo condotto una simile valutazione non in cieco di 87 aspirati di midollo osseo da pazienti con malignità mieloidi e linfoidi de novo e post-trattamento, citopenie benigne e midolli negativi, e abbiamo identificato prevalentemente l’eritrofagocitosi di RBC maturi nel 39% di questi casi. Applicando la soglia quantitativa determinata dalla nostra analisi per i globuli rossi non nucleati fagocitati (eritrofagociti) a questo set di dati, troviamo che solo 3 degli 87 pazienti (5%) soddisferebbero questo criterio morfologico (4 per 1000 cellule). Allo stesso modo, se applichiamo la soglia quantitativa per i granulociti (1 per 1000 cellule), solo 4 degli 87 pazienti (4%) soddisferebbero questo criterio morfologico. Pertanto, anche se possiamo effettivamente trovare rari esempi di eritrofagocitosi negli strisci di aspirato di una grande minoranza di casi, l’applicazione di soglie quantitative rivela una bassa incidenza di emofagocitosi clinicamente significativa in una popolazione di pazienti che riflette quelli visti nella pratica diagnostica di routine.

Un recente studio di Ho et al. ha esaminato la specificità dell’emofagocitosi per HLH quantificando la quantità assoluta di emofagocitosi identificata in aspirati di midollo osseo di pazienti il cui referto diagnostico patologico descriveva l’emofagocitosi.10 Hanno dimostrato che la presenza di emofagocitosi, anche quando presente in quantità elevata, manca di specificità per la HLH. La nostra esperienza istituzionale è coerente con la loro conclusione che un’emofagocitosi significativa non è predittiva della diagnosi di HLH in assenza di caratteristiche cliniche preoccupanti per la malattia; tuttavia, la presenza di una sostanziale emofagocitosi è un reperto relativamente raro. L’emofagocitosi accidentale è stata riportata in 86 dei 8097 (1,1%) rapporti di biopsia del midollo osseo in-house allo Stanford University Hospital dal 2013-2017. La maggior parte dei referti indica un’emofagocitosi “rara” (61%) mentre il resto descrive un’emofagocitosi “sparsa”, “occasionale” o “vivace”. Un sottoinsieme (n=12) di questi ultimi casi è stato esaminato. Tutti i 12 casi hanno dimostrato l’eritrofagocitosi. La metà dei casi mostrano granulociti ingeriti e 3 casi hanno dimostrato cellule nucleate multiple all’interno di singoli HPC. Nessuno di questi pazienti è stato infine diagnosticato con HLH.

Una grande limitazione di questo studio è la sua natura retrospettiva. La nostra popolazione è limitata ai pazienti in cui la diagnosi clinica è stata valutata a fondo e una determinazione definitiva è stata fatta riguardo alla diagnosi di HLH. Abbiamo escluso i pazienti in cui la diagnosi definitiva era ambigua. Inoltre, anche se la nostra coorte include tutti i pazienti della nostra istituzione che hanno soddisfatto i criteri di valutazione, compresi i bambini, solo un singolo paziente nella nostra coorte aveva una mutazione omozigote diagnostica di HLH primaria, limitando l’applicabilità dei nostri risultati ai pazienti con forme genetiche della malattia. Infine, notiamo che mentre il test CD107a è stato descritto come un test più sensibile per la HLH primaria,13 questo test recentemente sviluppato non è stato utilizzato in questa coorte retrospettiva.

In definitiva, la diagnosi di HLH si basa sulla valutazione approfondita dei pazienti nel contesto clinico appropriato. Allo stesso modo, l’esame microscopico degli strisci di aspirato midollare in pazienti sospettati di avere HLH richiede un’attenta valutazione della presenza di emofagocitosi. I nostri risultati dimostrano che le soglie quantitative del lignaggio delle cellule ingerite, da sole o in combinazione, predicono accuratamente la diagnosi finale di HLH. Dimostriamo inoltre che l’identificazione di un singolo emofagocita contenente più cellule ematopoietiche nucleate nel suo citoplasma si comporta in modo simile al nostro approccio quantitativo. Con la convalida esterna e ulteriori studi prospettici, speriamo che questi dati aiutino a fornire un metodo per patologi e clinici per valutare sistematicamente e classificare accuratamente i pazienti con HLH e contribuire alla creazione di linee guida di consenso di diagnosi e segnalazione.

Footnotes

↵* BAM e RSO hanno contribuito equamente a questo lavoro.
Controlla la versione online per le informazioni più aggiornate su questo articolo, i supplementi online e le informazioni sulla divulgazione degli autori &: www.haematologica.org/content/103/10/1635

Ricevuto il 17 dicembre 2017.
Accettato il 13 giugno 2018.

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