Guanidina

Proteine di membrana

La guanidina e le soluzioni SDS sono solventi denaturanti ma volevamo, naturalmente, caratterizzare anche gli stati nativi delle proteine di membrana. La difficoltà qui era che non c’era ancora un consenso su come definire o concepire lo stato nativo – che, per i nuovi arrivati come noi, si traduceva in incertezza, perché non avevamo il tipo di esperienza che ci avrebbe permesso di fare un’ipotesi accorta su quale delle idee contendenti avrebbe potuto rivelarsi corretta.

Anche il bilayer fosfolipidico, l’unico concetto indispensabile per la comprensione minima delle membrane cellulari, veniva ancora contestato, nonostante fosse stato dimostrato per la prima volta nei globuli rossi quasi 50 anni prima e fosse davvero l’unica disposizione concepibile sulla base della termodinamica, una diretta conseguenza delle classiche misurazioni di Irving Langmuir del 1917 con monostrati di sostanze anfifile. Ho descritto l’accettazione ridicolmente lenta del concetto di bilayer nel periodo intermedio nel mio libro, Ben Franklin Stilled the Waves . Il punto qui è che lo scetticismo persisteva ancora quando siamo stati coinvolti nella ricerca sulle membrane.

E tra coloro che erano convinti del bilayer lipidico, il modo di incorporazione delle proteine nelle membrane era ancora aperto al dibattito. Alcuni, come il nostro collega di Duke David Robertson, erano riluttanti a credere che le proteine potessero effettivamente penetrare o attraversare un bilayer. Due immagini concettuali abbastanza disparate, prese da una conferenza alla New York Academy of Sciences nel 1972, sono mostrate nella Figura 3. Una è la “membrana unitaria” di Robertson con le proteine totalmente all’esterno. L’altra è la visione di Vanderkooi dei complessi del citocromo ossidasi nelle membrane mitocondriali: la proteina è posizionata in modo più realistico, ma non c’è ancora alcuna concezione di distinti domini idrofili e idrofobici e di come essi possano dettare l’interazione proteina-lipide. Più tardi, nello stesso anno 1972, l’immagine idealizzata ormai convenzionale dei bilayer fosfolipidici, con proteine funzionanti che li attraversano, divenne finalmente popolare grazie al modello del “mosaico fluido” di Singer e Nicolson.

Fig. 3. Due immagini concettuali disparate delle proteine di membrana, entrambe proposte allo stesso incontro a New York nel 1972: (a) Robertson pensava che le proteine fossero disposte asimmetricamente, al di fuori delle due superfici bilayer; (b) la visione di Vanderkooi dei complessi di citocromo ossidasi in sezione trasversale.

In laboratorio questi erano tempi eccitanti, i più eccitanti che io possa ricordare. Abbiamo imparato a usare detergenti benigni, che, a differenza di SDS, potrebbero solubilizzare le proteine di membrana senza denaturazione grossolana, in un ambiente che simula lo stato nativo, ma un ambiente in cui sarebbero anche facilmente accessibili per la caratterizzazione molecolare – un progresso in cui siamo stati in parte anticipati da due simpatici giovani finlandesi, Kai Simons e Ari Helenius .

In pratica eravamo ancora per lo più limitati a misurare il peso molecolare e a chiedere quante catene polipeptidiche per molecola, ma le proteine a cui erano rivolte queste domande erano state separate dal trattamento detergente da altri componenti della membrana. La cosa più importante è che molte delle proteine avevano una funzione cellulare nota e le nostre misure erano pertinenti a queste funzioni. Ho già menzionato i globuli rossi, ma in realtà siamo riusciti a coprire una gamma di argomenti biologicamente rilevanti, spronati in molti casi dallo zelo missionario degli studenti. Per esempio, uno studente laureato in fisiologia, Stuart Grefrath, con un interesse in neurofisiologia, è venuto nel nostro laboratorio per enumerare le catene polipeptidiche di una membrana eccitabile – in questo caso dal nervo olfattivo dell’aguglia – e questo ci ha portato al successivo coinvolgimento con diversi altri sistemi di trasporto attivo. (Stuart stesso purtroppo morì a causa di una malattia cardiovascolare congenita prima che potesse realizzare la sua promessa iniziale con una carriera indipendente). La mielina cerebrale era un’altra membrana del sistema nervoso che abbiamo esaminato.

Degno di nota sono anche due visitatori del laboratorio che hanno scelto di lavorare insieme: Neal Robinson, un borsista post-dottorato, e Leon Visser, che era in congedo sabbatico dal CSIR di Pretoria, Sud Africa). Hanno fatto un lavoro molto accurato nel definire quantitativamente la struttura del dominio del citocromo b5, una sorta di prototipo per illustrare come le proteine di membrana sono attaccate alle membrane e continuano a svolgere la loro funzione nel citoplasma adiacente.

In altri progetti abbiamo risposto alle richieste di colleghi lontani. Ho già menzionato il lavoro con Arthur Karlin sul recettore dell’acetilcolina di un pesce elettrico. Un altro esempio era la rodopsina posteriore, per la quale abbiamo fatto misure in soluzione detergente su richiesta di Walter Stoeckenius dell’Università di California. C’era una domanda importante qui, legata al meccanismo dell’attività di pompaggio protonico di questa proteina: la proteina nativa è funzionalmente un monomero o (come alcuni dati sembravano suggerire) è un trimero? La nostra proteina solubilizzata era indiscutibilmente un monomero e l’evidenza spettrale indicava che stava attraversando lo stesso ciclo di cambiamenti molecolari come nella membrana nativa.

Nella maggior parte dei casi non siamo stati direttamente coinvolti nel cercare di capire come funzionavano i recettori o le pompe o i canali, ma inevitabilmente siamo diventati consapevoli di quali fossero i problemi. È stata un’esperienza davvero arricchente, molto diversa dai giorni in cui l’albumina del siero e la β-lattoglobulina (ottenuta da fornitori commerciali) erano gli obiettivi principali della nostra ricerca.

Nel caso delle pompe ioniche siamo effettivamente entrati nella fisiologia, soprattutto a livello di ipotesi o teoria; abbiamo imparato a modellare schemi cinetici con un computer; abbiamo partecipato a conferenze appropriate; ecc. Il nostro ultimo congedo sabbatico – al Max Planck Institute di Heidelberg – è stato importante in questo senso. Il presidente del dipartimento di fisiologia di Duke, Ted Johnson, si unì a noi in questa occasione, così eravamo in tre a collaborare attivamente. Ted era un appassionato di computer da molto tempo, e aveva collegato ogni singolo membro della facoltà di fisiologia alla struttura centrale del computer del North Carolina Research Triangle prima che diventasse di moda spendere i fondi del dipartimento in quel modo. A quei tempi dovevamo scrivere i nostri programmi per il computer, il che era difficile per me, ma credo che abbiamo ottenuto alcuni risultati utili, soprattutto su modelli cinetici per il ciclo di pompaggio della pompa Na,K guidata dall’ATP. Abbiamo lavorato in orari poco ortodossi, compresi i fine settimana e le vacanze, il che a volte ha scoraggiato i nostri ospiti di Heidelberg, che erano abituati a spegnere il riscaldamento centrale quando il laboratorio non era occupato. Circa ogni dieci giorni andavamo oltre il confine a Strasburgo per un pranzo gourmet – accompagnato da vini alsaziani, il cui sapore ci è piaciuto da allora.