Giunzione di Holliday

Le due vie per la ricombinazione omologa negli eucarioti, mostrando la formazione e la risoluzione delle giunzioni di Holliday

La giunzione di Holliday è un intermediario chiave nella ricombinazione omologa, un processo biologico che aumenta la diversità genetica spostando i geni tra due cromosomi, così come gli eventi di ricombinazione sito-specifici che coinvolgono le integrasi. Sono inoltre coinvolti nella riparazione delle rotture a doppio filamento. Inoltre, le strutture cruciformi che coinvolgono le giunzioni di Holliday possono sorgere per alleviare la tensione elicoidale nelle sequenze simmetriche nelle supercoil del DNA. Mentre le giunzioni a quattro braccia appaiono anche in molecole di RNA funzionali, come l’RNA spliceosomiale U1 e il ribozima a forcina del virus del ringspot del tabacco, queste di solito contengono nucleotidi non appaiati tra i domini a doppia elica appaiati, e quindi non adottano strettamente la struttura Holliday.

Le giunzioni Holliday nella ricombinazione omologa sono tra sequenze identiche o quasi identiche, portando a una disposizione simmetrica delle sequenze intorno alla giunzione centrale. Questo permette che si verifichi un processo di migrazione dei rami in cui i filamenti si muovono attraverso il punto di giunzione. La scissione, o risoluzione, della giunzione di Holliday può avvenire in due modi. La scissione dell’insieme originale di filamenti porta a due molecole che possono mostrare la conversione genica ma non il crossover cromosomico, mentre la scissione dell’altro insieme di due filamenti fa sì che le molecole ricombinanti risultanti mostrino il crossover. Tutti i prodotti, indipendentemente dalla scissione, sono eteroduplessi nella regione di migrazione della giunzione di Holliday.

Molte proteine sono in grado di riconoscere o distorcere la struttura della giunzione di Holliday. Una di queste classi contiene enzimi che risolvono le giunzioni, a volte in modo sequenza-specifico. Tali proteine distorcono la struttura della giunzione in vari modi, spesso tirando la giunzione in una conformazione non impilata, rompendo le coppie di basi centrali e/o cambiando gli angoli tra i quattro bracci. Altre classi sono le proteine di migrazione dei rami che aumentano il tasso di scambio di ordini di grandezza, e le ricombinasi sito-specifiche. Nei procarioti, le risolventi della giunzione di Holliday rientrano in due famiglie, integrasi e nucleasi, che sono strutturalmente simili anche se le loro sequenze non sono conservate.

Negli eucarioti, due modelli primari per come la ricombinazione omologa ripara le rotture del doppio filamento nel DNA sono la via della riparazione della rottura del doppio filamento (DSBR) (talvolta chiamata modello della doppia giunzione di Holliday) e la via dell’annealing del filamento dipendente dalla sintesi (SDSA). Nel caso della rottura del doppio filamento, l’estremità 3′ viene degradata e l’estremità 5′ più lunga invade il cromatide sorella contiguo, formando una bolla di replicazione. Quando questa bolla si avvicina al DNA rotto, il filamento antisenso 5′ più lungo invade nuovamente il filamento senso di questa porzione di DNA, trascrivendo una seconda copia. Quando la replicazione finisce, entrambe le code sono ricollegate per formare due giunzioni di Holliday, che vengono poi scisse in una varietà di schemi dalle proteine. Un’animazione di questo processo può essere vista qui.

Le rotture del DNA a doppio filamento nei batteri sono riparate dalla via RecBCD della ricombinazione omologa. Le rotture che si verificano solo su uno dei due filamenti di DNA, note come gap a singolo filamento, si pensa siano riparate dal percorso RecF. Entrambe le vie RecBCD e RecF includono una serie di reazioni note come migrazione dei rami, in cui singoli filamenti di DNA vengono scambiati tra due molecole incrociate di DNA duplex, e risoluzione, in cui queste due molecole incrociate di DNA vengono tagliate e riportate al loro normale stato a doppio filamento. La ricombinazione omologa si verifica in diversi gruppi di virus. Nei virus del DNA come l’herpesvirus, la ricombinazione avviene attraverso un meccanismo di break-and-rejoin come nei batteri e negli eucarioti. Nei batteri, la migrazione dei rami è facilitata dal complesso RuvABC o dalla proteina RecG, motori molecolari che usano l’energia dell’idrolisi dell’ATP per spostare la giunzione. La giunzione deve poi essere risolta in due duplex separati, ripristinando la configurazione parentale o una configurazione cross-over. La risoluzione può avvenire in modo orizzontale o verticale durante la ricombinazione omologa, dando prodotti di patch (se nello stesso orientamento durante la riparazione della rottura del doppio filamento) o prodotti di splice (se in orientamenti diversi durante la riparazione della rottura del doppio filamento). RuvA e RuvB sono proteine di migrazione dei rami, mentre RuvC è un enzima che risolve le giunzioni.

Ci sono prove di ricombinazione in alcuni virus a RNA, in particolare virus ssRNA a senso positivo come retrovirus, picornavirus e coronavirus. C’è controversia sul fatto che la ricombinazione omologa si verifichi in virus ssRNA a senso negativo come l’influenza.

RisoluzioneModifica

Nel lievito in erba Saccharomyces cerevisiae, le giunzioni di Holliday possono essere risolte da quattro diversi percorsi che rappresentano essenzialmente tutta la risoluzione della giunzione di Holliday in vivo. Il percorso che produce la maggior parte dei crossover nel lievito in erba S. cerevisiae, e possibilmente nei mammiferi, coinvolge le proteine EXO1, l’eterodimero MLH1-MLH3 (chiamato MutL gamma) e SGS1 (ortologa della sindrome di Bloom elicasi). L’eterodimero MLH1-MLH3 si lega preferenzialmente alle giunzioni di Holliday. È un’endonucleasi che produce rotture a singolo filamento nel DNA a doppio filamento superavvolto. L’eterodimero MLH1-MLH3 promuove la formazione di ricombinanti crossover. Mentre le altre tre vie, che coinvolgono le proteine MUS81-MMS4, SLX1 e YEN1, rispettivamente, possono promuovere la risoluzione della giunzione di Holliday in vivo, l’assenza di tutte e tre le nucleasi ha solo un impatto modesto sulla formazione di prodotti crossover.

I mutanti doppi eliminati sia per MLH3 (percorso principale) che per MMS4 (percorso minore) hanno mostrato un crossing over drasticamente ridotto rispetto al wild-type (da 6 a 17 volte); tuttavia la vitalità delle spore era ragionevolmente alta (62%) e la disgiunzione cromosomica sembrava per lo più funzionale.

Anche se MUS81 è un componente di una via di crossover minore nella meiosi del lievito in erba, delle piante e dei vertebrati, nel protozoo Tetrahymena thermophila, MUS81 sembra essere parte di una via di crossover essenziale, se non predominante. Il percorso MUS81 sembra anche essere il percorso di crossover predominante nel lievito di fissione Schizosaccharomyces pombe.

Le proteine MSH4 e MSH5 formano una struttura etero-oligomerica (eterodimero) nel lievito e negli esseri umani. Nel lievito Saccharomyces cerevisiae MSH4 e MSH5 agiscono specificamente per facilitare il crossover tra cromosomi omologhi durante la meiosi. Il complesso MSH4/MSH5 lega e stabilizza le doppie giunzioni di Holliday e promuove la loro risoluzione in prodotti di crossover. Un mutante MSH4 ipomorfo (parzialmente funzionale) di S. cerevisiae ha mostrato una riduzione del 30% del numero di crossover in tutto il genoma e un gran numero di meiosi con cromosomi non di scambio. Tuttavia, questo mutante ha dato origine a modelli di vitalità delle spore che suggeriscono che la segregazione dei cromosomi non di scambio è avvenuta in modo efficiente. Quindi in S. cerevisiae una corretta segregazione apparentemente non dipende interamente dai crossover tra coppie omologhe.