Gamma-Glutamyl Transpeptidase

Attività e Specificità

Quindi la reazione catalizzata da questo enzima è generalmente intesa come il trasferimento di un gruppo γ-glutamilico ad una varietà di molecole accettore come acqua, aminoacidi, dipeptidi e lo stesso donatore γ-glutamil, a seconda delle condizioni di reazione. Queste proprietà catalitiche sono associate al meccanismo catalitico della GGT, in cui la reazione procede con un meccanismo di acilazione-deacilazione a doppio spostamento attraverso un intermedio γ-glutamil-enzimatico.

Come previsto dalle strutture del substrato naturale glutatione e dei suoi derivati, la GGT riconosce strettamente la parte γ-glutamilica, ma ha una specificità piuttosto ampia del substrato rispetto al gruppo di partenza (Xaa). Il glutatione, i suoi coniugati S, il disolfuro di glutatione, i di- o tripeptidi γ-glutamil, la glutammina, i derivati l-α-metilici delle ammidi γ-glutamil, il leucotriene C4, i derivati poli-γ-glutamil sono tutti accettati come substrati. Substrati artificiali come l-γ-glutamyl-p-nitroanilide (l-γ-Glu-pNA) e la fluorescente l-γ-glutamyl-7-amino-4-metilcumarina (l-γ-Glu-AMC) sono substrati attivi comunemente usati in presenza o in assenza di accettori γ-glutamyl (vedi sotto) per il saggio di transpeptidasi o idrolasi, rispettivamente.

La specificità del substrato rispetto all’accettore è stata studiata più estesamente con la GGT del rene di ratto. Gli isomeri l di amminoacidi neutri come l-cistina, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys e l-Ser sono buoni accettori, ma gli amminoacidi idrofobici e a catena ramificata come l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile e l-Val sono substrati piuttosto poveri. Gli amminoacidi d e gli amminoacidi α-sostituiti non agiscono come substrati accettori. Pertanto l’uso di d-γ-Glu-pNA è un modo conveniente per sopprimere l’autotranspeptidazione nella misurazione dell’attività dell’idrolasi. Poiché il sito di legame dell’accettore si sovrappone ai sottositi per la parte Cys-Gly del glutatione, l’enzima preferisce i dipeptidi con Gly al C-terminale come l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cystinyl-bis-Gly, Gly-Gly e l-Ser-Gly come substrati accettori in ordine decrescente di attività relativa. I peptidi con più di due residui aminoacidici sono accettori molto poveri. I valori Km per gli aminoacidi accettori e i dipeptidi sono relativamente alti, cadendo nell’intervallo da 0,1 a 5 mM, ma Gly-Gly (Km=3 mM) è più convenientemente usato come substrato accettore per l’attività della transpeptidasi. Alte concentrazioni di molecole accettore inibiscono GGT in modo competitivo rispetto al donatore γ-glutamilico (γ-Glu-Xaa), probabilmente a causa della sovrapposizione del sito di legame per Xaa e quello per l’accettore. La specificità del substrato rispetto al sottosito Cys dipende dall’origine dell’enzima; l’enzima E. coli, per esempio, preferisce gli aminoacidi basici (l-Arg, l-Lys e l-His) e gli aminoacidi aromatici (l-Phe, l-Trp e l-DOPA) in questo sito. Tuttavia, la specificità dell’accettore deve essere presa con attenzione, perché l’attività apparente dipende anche dalla concentrazione effettiva dell’amminoacido deprotonato disponibile al pH in questione. L’attività relativamente alta osservata con Gly-Gly è dovuta in parte al basso pKa di questo dipeptide. I gruppi amminici deprotonati dei substrati accettori sembrano essere necessari per la transpeptidazione.

Il substrato donatore più ampiamente usato per il saggio dell’enzima è l-γ-Glu-pNA. Una tipica miscela di dosaggio per l’attività transpeptidasica dell’enzima del rene di ratto consiste in 5 mM di l-γ-Glu-pNA, 100 mM di Gly-Gly in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) a 25°C. L’aggiunta di una concentrazione sufficiente di Gly-Gly sopprime efficacemente l’idrolisi e l’autotranspeptidazione. Il pH ottimale di GGT è circa 7,5-9 per la transpeptidazione, ma la dipendenza dal pH è molto minore per l’idrolisi. Questo è coerente con il fatto che l’attività apparente della transpeptidasi dipende, in parte, dalla concentrazione effettiva del gruppo amminico libero degli accettori.

L’attività dell’idrolasi per la glutammina è aumentata fino a 12 volte aggiungendo modulatori diretti al sito accettore come maleato, ippurato e glicocholato. L’aggiunta di questi composti inibisce il legame dei substrati accettori e i donatori γ-glutamilici che occupano i sottositi Cys-Gly. L’aggiunta di donatori γ-glutamilici o il legame di inibitori al sito del donatore γ-glutamilico aumenta l’affinità di questi modulatori, indicando interazioni cooperative tra i siti di legame per i donatori γ-glutamilici e gli accettori (per una revisione vedi Tate & Meister ). Il sito accettore occupato da questi modulatori è suggerito per promuovere un cambiamento conformazionale di GGT in una forma attiva, facilitando così la formazione di uno stato di transizione. Questo è anche proposto per spiegare l’aumento del tasso di inattivazione degli enzimi dei mammiferi da parte di acivicina (vide infra), ma questo non è stato osservato con l’inibizione da un γ-monofluorofosfonato, un analogo dello stato di transizione diretto al sito attivo etichetta di affinità . Acivicin sembra legarsi a un residuo nucleofilo diverso dal nucleofilo catalitico della GGT dei mammiferi.

GGT è inibita in modo reversibile e competitivo da l- e d-γ-glutamyl-(o-carbossi)fenilidrazide (anthglutin, prodotto da Penicillium oxalicum) con un Ki di 8 μM, e nessuna tossicità acuta è riportata per i topi. Diversi analoghi del glutammato con un gruppo reattivo vicino al γ-carbossi agiscono come inibitori irreversibili. 6-Diazo-5-oxo-l-norleucina (DON), O-diazoacetyl-l-serina (l-azaserina) e l-(αS,5S)-α-amino-3-cloro-4,5-dihydro-5-isoxazoleacetic acid (acivicin o AT-125, prodotto da Streptomyces sviceus) sono potenti, ma non specifici inattivatori di GGT. L’acivicina è stata ampiamente utilizzata per sopprimere l’attività della GGT in vivo, anche se l’acivicina è altamente tossica inattivando un certo numero di glutammina amidotransferasi coinvolte nella biosintesi di nucleotidi, aminoacidi e amino zuccheri. Il complesso serina-borato si lega reversibilmente al sito di legame γ-glutamyl per inibire la GGT con un Ki di 20 μM . Questa scoperta classica ha portato a un inibitore potente e a legame lento, l’acido l-2-amino-3-boronobutanoico (γ-boroGlu). GGT è inibita con un Ki complessivo di 17 o 35 nM, ma l’inibizione è ancora reversibile. 2-Amino-4-(fluorofosfono)acido butanoico (γ-PFGlu), un analogo del glutammato con un fosforo elettrofilo che sostituisce il γ-carbossilico, è un potente agente di marcatura di affinità basato sul meccanismo e diretto al sito attivo di E. coli GGT. Questo composto inibisce rapidamente e irreversibilmente GGT per formare un addotto stabile, anionico e tetraedrico simile allo stato di transizione, che è adatto alla mappatura peptidica per identificare il nucleofilo catalitico di E. coli GGT (vide infra). Una serie di analoghi del glutammato γ-(monofenil)fosfono- e γ-fosfonodiester servono come inibitori basati sul meccanismo che inibiscono GGT in modo irreversibile mediante modifica covalente del suo nucleofilo catalitico. In particolare, i γ-fosfonodiesteri che incorporano il mimico strutturale di Cys-Gly e il suo gruppo carbossilico C-terminale esibiscono attività straordinariamente elevate verso la GGT umana, il tasso di inattivazione essendo da 130 a 6000 volte più veloce di quello dell’acivicina. L’inibizione è selettiva per la GGT e non si osserva tossicità. Uno di questi inibitori è disponibile in commercio con il nome di ‘GGsTop’ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

Un analogo non glutammato inibitore della GGT umana è stato trovato da uno screening ad alta produttività. Questo composto occupa il sito accettore del complesso γ-glutamil substrato con un Ki di 17,6 μM. L’inibitore è specie-selettivo, ma è reversibile, e una certa tossicità è riportata.

La reazione catalizzata da GGT si pensa di procedere con un meccanismo ping-pong attraverso un intermedio γ-glutamil-enzima come osservato con serina idrolasi. Il Thr Oγ N-terminale nella piccola subunità è il nucleofilo catalitico a cui è attaccato un gruppo γ-glutamilico (vedi Chimica strutturale). Il nucleofilo catalitico di GGT è stato identificato per la prima volta con E. coli GGT come il residuo N-terminale Thr (Thr391) nella piccola subunità tramite mappatura peptidica dell’enzima inattivato con γ-PFGlu . Questo residuo, corrispondente a Thr380 (enzima del rene di ratto) e Thr381 (enzima umano), è conservato tra tutte le GGT di cui sono note le sequenze primarie. Il nucleofilo catalitico della GGT umana è identificato come Thr381 dalla mappatura peptidica dell’enzima inattivato dall’etichetta di affinità γ-(monofenil)fosforo. Pertanto, la reazione catalizzata da GGT inizia con l’attacco nucleofilo del residuo Thr N-terminale nella piccola subunità sul γ-carbossi di un substrato donatore (γ-Glu-Xaa) per eliminare Xaa. L’enzima γ-glutamilico così formato reagisce con l’acqua (idrolisi) o con aminoacidi e dipeptidi (transpeptidazione e autotranspeptidazione) nella fase che determina il tasso.

GGT è un membro delle idrolasi nucleofile N-terminali (Ntn-idrolasi) come previsto dalla sua piega unica e dal processo di maturazione, in cui una forma dimerica attiva dell’enzima maturo è generata dall’elaborazione autocatalitica post-traslazionale del precursore cataliticamente inattivo. Questo è confermato dalla mutagenesi sito-diretta e dall’analisi strutturale a raggi X di enzimi batterici (vedi Chimica strutturale).