Frontiers in Physiology

Introduzione

Il progetto HUMAN GENOME ha trasformato la nostra comprensione dell’unità di base dell’informazione genetica con l’RNA che emerge come un regolatore versatile dei processi cellulari centrali (Thum e Condorelli, 2015). Gli RNA non codificanti (ncRNA), trascrizioni che non codificano proteine comprendono la classe più grande e sono arbitrariamente divisi in RNA non codificanti piccoli (<200 nucleotidi) e lunghi (lncRNA (>200 nucleotidi). I microRNA (miRNA) sono i piccoli ncRNA meglio studiati e rappresentano un ulteriore strato di regolatori post-trascrizionali che assorbono le perturbazioni e garantiscono la robustezza dei sistemi biologici (Liu e Olson, 2010; Ebert e Sharp, 2012; Rotllan et al., 2016).

Sforzi sostanziali sono stati ora diretti verso la dissezione della funzione dei lncRNA. Nel sistema cardiovascolare, gli lncRNA sono stati segnalati per svolgere ruoli chiave nella fisiologia e nella malattia e il targeting degli lncRNA per nuovi interventi terapeutici è stato esplorato (Uchida e Dimmeler, 2015; Boon et al., 2016; Buhrke et al., 2018). Qui discuteremo gli strumenti sperimentali per determinare la struttura dell’RNA che possono offrire intuizioni uniche sulla funzione dei lncRNA nel sistema cardiovascolare.

Challenges in Assessing lncRNA Functionality

Le caratteristiche uniche dei lncRNA sono state ampiamente studiate (Guttman e Rinn, 2012; Ulitsky e Bartel, 2013; Bar et al., 2016; Ulitsky, 2016). Diverse caratteristiche dei lncRNA rendono la valutazione funzionale impegnativa. In genere, gli lncRNA mostrano una scarsa conservazione tra le specie, mostrando solo “macchie” di basi conservate circondate da grandi sequenze apparentemente non vincolate (Ponjavic et al., 2007; Guttman et al., 2009; Necsulea et al., 2014; Washietl et al., 2014). Inoltre, gli lncRNA mostrano una bassa abbondanza che limita le loro modalità e siti di azione (Mercer et al., 2008; Cabili et al., 2011, 2015; Washietl et al., 2014; Ulitsky, 2016; Wilk et al., 2016; Jandura e Krause, 2017). In termini di modalità di funzione, sono state descritte attività cis e trans-regolatorie (Mercer e Mattick, 2013). Come cis-regolatori, gli lncRNA esercitano la loro funzione sui geni vicini dello stesso allele da cui sono trascritti, mostrando correlazione e perturbazione dell’espressione in modo allele-specifico. CARMEN, un lncRNA associato all’enhancer e un regolatore cruciale della specificazione cardiaca nelle cellule progenitrici cardiache umane ha dimostrato di agire in cis per controllare l’espressione del miR-143/145 (Ounzain et al., 2015). D’altra parte, agendo in trans-lncRNA possono controllare l’espressione genica a distanza dal loro sito di trascrizione, alterando lo stato della cromatina, influenzando la struttura nucleare o regolando la funzione della proteina (Vance e Ponting, 2014; Kopp e Mendell, 2018).

Intrigante, per alcuni lncRNA a bassa abbondanza l’atto della trascrizione sembra essere più importante del trascritto stesso. In uno studio seminale, Engreitz et al. (2016) hanno manipolato geneticamente 12 loci genomici che producono lncRNA per scoprire che 5 loci influenzavano l’espressione di un gene vicino in cis. L’espressione dei trascritti lncRNAs stessi non era richiesta ma invece i processi associati alla loro trascrizione erano critici (Engreitz et al., 2016).

L’RNA Interactome

Le suddette versatilità funzionali degli lncRNA derivano dalla loro capacità di conformarsi a diverse strutture e interazioni molecolari con proteine, RNA e DNA (Guttman e Rinn, 2012; Marchese et al., 2017). Nei complessi ribonucleoproteici (RNPs), gli lncRNA possono agire come impalcature per stabilizzare i complessi, dirigendoli verso specifici loci subcellulari o il DNA. Nelle cellule endoteliali, l’interazione del lncRNA MANTIS con le subunità catalitiche dell’ATPasi conferisce specificità al complesso di rimodellamento della cromatina switch/sucrose non-ferentable (SWI/SNF) dirigendolo verso un sottoinsieme di geni angiogenici e facilitando il rimodellamento dei nucleosomi e l’inizio della trascrizione (Leisegang et al., 2017; Zampetaki e Mayr, 2017). Infatti il legame di lncRNA a specifiche subunità ATPasi del complesso SWI/SNF è un comune meccanismo di regolazione (Cajigas et al., 2015; Zhu et al., 2016).

L’interazione degli lncRNA con i complessi della cromatina è particolarmente importante in quanto questi lncRNA-RNP possono innescare modifiche della cromatina attraverso l’interferenza con il macchinario che modifica la cromatina (Tsai et al., 2010; Brockdorff, 2013; Simon et al., 2013). Nel cuore, Chaer un lncRNA arricchito cardiaco agisce come un interruttore epigenetico interferendo con il complesso repressivo polycomb 2 (PRC2) e inibendo H3K27m3 a geni coinvolti nell’ipertrofia cardiaca (Wang et al, 2016), mentre l’lncRNA Fendrr, determinante per il mesoderma, può legarsi sia a PRC2 che ai complessi Trithorax group/MLL (TrxG/MLL) agendo come un fine tuner (Grote et al., 2013).

Oltre alle proteine, è stata descritta l’interazione degli lncRNA con il DNA. Questo può portare alla formazione di triplex RNA-DNA, una struttura che è diffusa in vivo e facilita il riconoscimento del gene target da parte degli lncRNA (Mondal et al., 2015). Questa interazione è stata elegantemente dimostrata in MEG3, un lncRNA arricchito nei fibroblasti cardiaci che promuove la fibrosi (Piccoli et al., 2017). MEG3 interagisce con il complesso PRC2 e forma strutture triplex RNA-DNA attraverso siti di legame ricchi di sequenza GA. L’immunoprecipitazione della cromatina RNA ha rivelato che MEG3 modula l’attività dei geni del percorso TGF-b e il riconoscimento del bersaglio avviene attraverso le strutture triplex (Mondal et al., 2015).

Le funzioni di regolazione degli RNA non codificanti lunghi si basano anche sulle interazioni RNA-RNA. Il crosstalk con i miRNA crea una rete intricata che esercita la regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica. I lncRNA possono ospitare siti di legame dei miRNA e agire come esche molecolari o spugne che sequestrano i miRNA lontano da altri trascritti. Degno di nota, la competizione tra lncRNA e miRNA per il legame agli mRNA bersaglio è stata riportata e porta alla de-repressione dell’espressione genica (Yoon et al., 2014; Ballantyne et al., 2016). Infine, gli lncRNA possono contenere sequenze di miRNA incorporate e servire come fonte di miRNA (Piccoli et al., 2017).

Collegamento della struttura dell’RNA alla funzione

Le molecole di RNA adottano interazioni terziarie di ordine superiore (Staple e Butcher, 2005; Wan et al., 2011). Anche se i legami tra struttura e funzione stanno emergendo, i domini strutturali che dominano l’interactome dell’RNA non sono ancora ben definiti. Le implicazioni funzionali della struttura del trascritto sono meglio comprese nella trasformazione dei miRNA primari (primiRNA) in miRNA maturi. Utilizzando saggi multipli di mutagenesi, sono state definite le strutture secondarie come la lunghezza dello stelo, l’accoppiamento della forcina, la dimensione e la posizione del bulge e la dimensione del loop apicale che contribuiscono alla biogenesi efficace dei miRNA (Auyeung et al., 2013; Fang e Bartel, 2015; Nguyen et al., 2015; Roden et al., 2017). Nei miRNA raggruppati che consistono in più geni di miRNA, la struttura terziaria è stata anche proposta per contribuire alla trasformazione in singoli miRNA maturi. È stato dimostrato un ruolo autoregolatore per la struttura terziaria del cluster miR-17∼92 nella sua maturazione e nel legame dei fattori ausiliari ai loop terminali conservati (Chakraborty et al., 2012). Recentemente, nel cluster miR-497∼195, sono state riportate mutazioni nella forcina miR-195a che influenzano l’elaborazione del miR-497a che risiede nello stesso cluster. L’analisi computazionale ha evidenziato differenze nella struttura terziaria dei primiRNA nei mutanti che possono influenzare il processo di maturazione (Lataniotis et al., 2017). Su una nota diversa, in primiR-30c-1 la struttura terziaria promuove l’interazione con SRSF3, un membro della famiglia delle proteine SR che facilita il riconoscimento e l’elaborazione dei primiRNA. Una singola variazione di sequenza G/A porta a un riarrangiamento strutturale della regione apicale del primiRNA che interessa i residui conservati posti nella parte basale del gambo e la generazione del miRNA maturo (Fernandez et al., 2017).

Negli lncRNA, la selezione che agisce sulla struttura piuttosto che sulla sequenza primaria può spiegare il rapido tasso di evoluzione, che ha portato all’ipotesi del “codice modulare dell’RNA” basata sulla visione che la selezione agisce sui domini strutturali (Wutz et al., 2002; Tsai et al., 2010; Guttman e Rinn, 2012). Alcune prove sperimentali supportano questo concetto. Il gene lncRNA MEG3 contiene tre moduli di struttura distinti M1, M2 e M3. L’analisi della delezione ha mostrato che i motivi M2 e M3 sono importanti per l’attivazione di p53. È interessante notare che una trascrizione ibrida di MEG3 in cui metà della sequenza primaria del motivo M2 è stata sostituita da una sequenza artificiale completamente estranea che mostrava una struttura secondaria simile, era pienamente funzionale nello stimolare la trascrizione mediata da p53 (Zhang et al., 2010).

Metodi di determinazione della struttura dell’RNA

I metodi di indagine chimica ed enzimatica possono fornire una comprensione della struttura secondaria dell’RNA (Ehresmann et al., 1987). Il probing enzimatico si basa su nucleasi che si legano all’RNA appaiato e non appaiato e lo digeriscono per generare frammenti di RNA che possono essere analizzati. D’altra parte, nel probing chimico vengono utilizzate sostanze chimiche di piccole dimensioni che reagiscono e modificano covalentemente i nucleotidi accessibili al solvente. Dopo la modifica o la scissione, le posizioni sono tipicamente mappate dalla trascrizione inversa, che ferma o introduce una mutazione nel cDNA (Wilkinson et al., 2006). Un’analisi del cDNA risultante viene poi utilizzata per determinare la posizione del nucleotide e la frequenza di modifica. Il sequenziamento di prossima generazione (NGS) può essere applicato per sequenziare direttamente i prodotti cDNA. Questo permette la caratterizzazione strutturale dell’RNA a livello di trascrittoma in un unico esperimento (Lucks et al., 2011; Incarnato et al., 2014; Loughrey et al., 2014; Rouskin et al., 2014). Anche se inizialmente le tecnologie sono state stabilite per analizzare la struttura dell’RNA in vitro, è stata riportata anche la caratterizzazione strutturale in vivo principalmente attraverso l’uso di sonde che possono diffondere rapidamente attraverso le membrane (Spitale et al., 2013; Ding et al., 2014; Spitale et al., 2015; Flynn et al, 2016).

Enzymatic Probing

PARS

PARS (analisi parallela della struttura dell’RNA) è un metodo ad alta produttività di sondaggio enzimatico che misura le proprietà strutturali di pool di trascrizioni poliadenilate isolate che sono rinaturate in vitro e trattate con RNasi V1 o S1. La RNasi V1 e la RNasi S1 scindono i legami fosfodiesteri 3′ dell’RNA a doppio e a singolo filamento, rispettivamente, permettendo la valutazione della conformazione a doppio o a singolo filamento (Kertesz et al., 2010).

Frag-Seq

Frag-Seq (fragmentation sequencing) è un metodo enzimatico che utilizza una nucleasi P1 per scindere specificamente l’RNA a singolo filamento. Il sequenziamento ad alta velocità analizza poi i frammenti generati. Questo flusso di lavoro fornisce un “profilo di accessibilità dell’RNA” che è paragonato ai test di ipersensibilità alla DNasi sulla cromatina (Underwood et al., 2010). Degno di nota, Frag-seq isola frammenti <200 basi dopo la scissione RNase P1, quindi grandi RNA forse sottorappresentati. Come Frag-seq e PARS in grado di fornire dati complementari un approccio combinato potrebbe migliorare l’accuratezza del genoma a livello di struttura RNA misure (Wan et al., 2011).

Chemical Probing

DMS Probing

Il dimetil solfato (DMS) è un reagente specifico della base che può legare e alterare lo stato di metilazione dei nucleotidi di adenosina e citosina spaiati (Tijerina et al., 2007; Rouskin et al., 2014). DMS footprinting è ottimizzato per l’analisi strutturale di RNA. Il legame delle proteine all’RNA genera una “impronta” che può essere tracciata a causa di alterazioni nella struttura dell’RNA. La dimensione del trascritto che può essere valutato è piuttosto piccolo (<500 nt), ma questo metodo può essere eseguito sia in vitro che in vivo come DMS può facilmente penetrare la membrana cellulare. DMS-seq che combina la metilazione DMS con NGS è stato recentemente eseguito in vivo (Ding et al., 2014; Rouskin et al., 2014).

Targeted Structure-Seq

Targeted Structure-Seq si basa sulla metilazione di RNA da DMS eseguita in vivo. Successivamente, l’RNA viene isolato dalle cellule e i siti di metilazione vengono determinati utilizzando primer specifici del gene per la reazione di trascrizione inversa. Il sequenziamento dei frammenti derivati dalla DMS può essere usato per valutare la conformazione cellulare dell’RNA. Sulla base di questo metodo, modelli strutturali di elementi all’interno Xist sono stati sviluppati (Fang et al., 2015). Anche se inizialmente riportato utilizzando DMS questo flusso di lavoro può essere adattato per altri reagenti probing.

SHAPE

SHAPE (selettiva 2′-idrossilazione acilazione da estensione del primer) può interrogare la struttura di RNA sia in vitro che in vivo utilizzando la chimica NMIA e suoi derivati per rilevare regioni flessibili nella struttura secondaria di RNA (Wilkinson et al., 2006; Weeks e Mauger, 2011). Diversi reagenti SHAPE sono stati testati al fine di migliorare il rapporto segnale-sfondo (Lee et al., 2017). In SHAPE, i gruppi 2′-idrossile di tutti e quattro i nucleotidi sono selettivamente acilato quando flessibile e non accoppiato. Questo si traduce nella formazione di addotti covalenti SHAPE che bloccano la trascrizione inversa portando a frammenti di cDNA troncati. Le reattività di SHAPE possono quindi essere utilizzate per modellare le strutture secondarie e quantificare qualsiasi processo che modula la dinamica dell’RNA.

SHAPE-MaP

SHAPE-MaP (SHAPE and mutational profiling) è stato il primo a combinare il protocollo SHAPE con NGS. Inizialmente eseguita e riportata per definire il genoma di HIV-1 RNA, SHAPE-MaP è una tecnica altamente sensibile che ha permesso la scoperta rapida, de novo e la validazione diretta di nuovi motivi funzionali (Siegfried et al., 2014; Mustoe et al, 2018).

In-cell SHAPE-Seq

In-cell SHAPE-Seq è una modifica della tecnica SHAPE-Seq che combina la SHAPE-seq con misure di espressione genica per chiarire l’associazione di struttura e funzione di RNA in vivo. Ha rivelato meccanismi di regolazione traslazionale in E. coli in vivo (Watters et al., 2016).

icSHAPE-seq

icSHAPE-seq (in vivo click SHAPE sequencing) utilizza il NAI-N3 chimico SHAPE in cella seguito da arricchimento chimico selettivo di RNA NAI-N3-modificato che fornisce un migliore rapporto segnale-rumore (Flynn et al., 2016). Follow-up NGS permette l’identificazione accurata alla risoluzione del singolo nucleotide. Nelle cellule staminali embrionali di topo è stato dimostrato che in vitro il ripiegamento dell’RNA è programmato interamente dalla sequenza, mentre in vivo, la struttura dell’RNA dipende dal contesto dell’ambiente intracellulare e dall’interazione con le proteine leganti l’RNA che possono portare a riarrangiamenti strutturali focali (Spitale et al., 2015). Quindi, questo saggio offre l’eccitante possibilità di visualizzare il structurome RNA in vivo in presenza o in assenza di stimolazione.

RNA Structurome and Interactome Determination

PARIS

PARIS (psoralen analysis of RNA interactions and structures) è stato recentemente sviluppato per determinare sia la struttura che le interazioni dell’RNA in vivo. Utilizza il reticolante altamente specifico e reversibile dell’acido nucleico, il derivato dello psoralene 4′-aminomethyltrioxsalen, per fissare le coppie di basi nelle cellule viventi. Successivamente, la parziale RNasi e la completa digestione delle proteinasi portano alla purificazione di una serie di piccoli frammenti di RNA reticolati e direttamente accoppiati in base. La purificazione dei frammenti reticolati utilizzando l’elettroforesi 2D, seguita dalla legatura di prossimità dei frammenti di RNA duplex, dall’inversione dei legami incrociati e dal sequenziamento ad alta velocità rivela l’accoppiamento diretto delle basi tra i frammenti. Sulla base di queste letture, modelli di strutture e interazioni di RNA possono essere generati con alta specificità e sensibilità (Lu et al., 2016). Utilizzando questo approccio è stato interrogato un modello per la struttura di ordine superiore di Xist (Lu et al., 2016). Incoraggiante, questi risultati sono in accordo con gli studi cristallografici dei domini definiti in vitro (Arieti et al., 2014).

Determinazione della struttura di lncRNA

La determinazione della struttura di lncRNA in vivo è estremamente impegnativa poiché sono altamente eterogenei con regioni con base-pairing ben definito, altre senza base-pairing e regioni con strutture multiple. Inoltre, gli lncRNA possono estendersi per migliaia di nucleotidi, sono espressi in bassa abbondanza e tendono a far parte di complessi multicomponenti (Busan e Weeks, 2017). Tuttavia, la struttura di diversi lncRNA è stata determinata sperimentalmente (Tabella 1).

Xist

Questo è un lncRNA molto lungo (17.000 nucleotidi) che controlla l’inattivazione del cromosoma X. Si diffonde su tutto il cromosoma mentre innesca modifiche epigenetiche stabili attraverso il reclutamento del complesso PRC2 e l’arricchimento per la modifica repressiva della cromatina H3K27me3 (Simon et al., 2013; Fang et al., 2015; Smola et al., 2016). I dati SHAPE in vivo hanno identificato 33 regioni in Xist che formano strutture secondarie ben definite collegate da regioni strutturalmente variabili e dinamiche.

RepA

Questo è un lncRNA murino di 1.600 nucleotidi codificato da un promotore interno sul filamento senso del gene Xist. Applicando SHAPE e DMS chemical probing in vitro, è stata rivelata una struttura intricata di tre moduli di piegatura indipendenti. L’analisi filogenetica e la modellazione computazionale 3D hanno dimostrato un’architettura terziaria definita che può formarsi autonomamente in assenza di partner proteici (Liu et al., 2017a).

Rox1/Rox2

In Drosophila la compensazione del dosaggio si ottiene usando due lncRNA che sono trascritti dal cromosoma X. Gli RNA dell’X 1 e 2 (roX1 e roX2) sono lunghi rispettivamente 3.700 e 1.200 nucleotidi. Il sondaggio SHAPE in vitro e l’analisi PARS hanno rivelato motivi strutturali comuni, conservati e distinti che possono funzionare come siti di targeting e piattaforme di assemblaggio per il complesso letale specifico maschile (Ilik et al., 2013).

SRA

L’attivatore RNA del recettore degli steroidi umano (SRA) è un lncRNA di 870 nucleotidi che deriva da un gene che codifica sia lncRNA che trascrizioni di proteine. La struttura di SRA è stata interrogata sperimentalmente usando SHAPE e DMS chemical probing in vitro. In parallelo, è stato eseguito il sondaggio enzimatico RNase V1. È stato dimostrato che SRA consiste di quattro domini distinti con una varietà di strutture secondarie (Novikova et al., 2012). Ancora più importante, l’analisi strutturale comparativa tra il topo e l’uomo ha fortemente suggerito che un gran numero di cambiamenti evolutivi ha avuto un effetto mutazionale minimo sulla proteina derivata dal locus mentre stabilizzava il nucleo strutturale dell’RNA (Novikova et al, 2012).

HOTAIR

Associato all’aneurisma sporadico dell’aorta toracica attraverso la regolazione della deposizione della matrice extracellulare e l’apoptosi delle cellule muscolari lisce aortiche umane, questo lncRNA svolge un ruolo chiave nel sistema cardiovascolare (Guo et al., 2017). Nei pazienti con insufficienza cardiaca non-end stage HOTAIR era tra un pannello di lncRNA che erano significativamente modulati (Greco et al., 2016). Sono stati proposti anche un ruolo protettivo di HOTAIR nei cardiomiociti (Gao et al., 2017) e come biomarcatore circolante per l’infarto miocardico acuto e le malattie cardiache congenite (Jiang et al., 2018). Hotair è lungo 2.148 nucleotidi rendendo la determinazione strutturale estremamente impegnativa. Per affrontare questo problema è stato stabilito un protocollo di purificazione non denaturante per ottenere una forma omogenea e monodispersa. Moduli strutturali e distinti elementi evolutivamente conservati sono stati determinati in vitro utilizzando il probing chimico con reagenti SHAPE e DMS (Somarowthu et al., 2015).

Braveheart

Braveheart è un lncRNA di 590 nucleotidi che agisce in trans per regolare l’impegno del lineage cardiovascolare. La sua struttura secondaria è stata valutata sperimentalmente utilizzando SHAPE e DMS probing in vitro. È emerso che Braveheart è organizzato in una struttura modulare altamente intricata che comprende tre domini, composti da 12 eliche, 8 loop terminali, 5 loop interni di grandi dimensioni e una giunzione a cinque vie. Intrigante, include un 5′ loop interno asimmetrico ricco di G (AGIL) e un tratto di 55 nucleotidi all’estremità 3′ che mostra un’alta reattività che suggerisce una bassa probabilità di struttura. La delezione genetica di questo specifico frammento di 11 nucleotidi ha dimostrato che il motivo AGIL è essenziale per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cardiomiociti attraverso il legame della proteina zing-finger CNBP/ZNF9 (Xue et al., 2016).

Direzioni future

La determinazione della struttura degli RNA combinata con manipolazioni genetiche può chiarire gli importanti domini funzionali degli lncRNA. A questo scopo, strumenti sperimentali avanzati, bioinformatica e ingegneria del genoma dovrebbero essere integrati. Il sistema di editing genico CRISPR/Cas9 è emerso come una tecnologia robusta che può essere utilizzata per generare modifiche mirate a precisi loci genomici. Cas9, una nucleasi che può indurre rotture a doppio filamento (DSB) al DNA, può essere guidata nelle immediate vicinanze del motivo protoadiacente NGG da una molecola di RNA (sgRNA) costituita da una piccola sequenza variabile lunga 20 nucleotidi e da un RNA adattatore transattivante. Precise inserzioni, delezioni o sostituzioni di basi possono essere introdotte in un sito DSB (Lin et al., 2014) in cellule primarie e in vivo in modelli murini di malattia (Platt et al., 2014; Abrahimi et al., 2015). Una versione modificata del sistema CRISPR/Cas9 è stata recentemente impiegata per lo screening su scala genomica di lncRNA funzionali. Questo approccio di interferenza CRISPR utilizza una nucleasi Cas9 morta (dCas9) che non è in grado di indurre DSB al DNA. Fuso a un dominio repressore (ad esempio, KRAB) (Liu et al., 2017b) o un dominio di attivazione (ad esempio, VP64) (Konermann et al., 2015; Bester et al., 2018) dCas9 e può essere guidato da sgRNA a loci specifici nella regione di regolazione a monte per innescare la repressione o l’attivazione della trascrizione lncRNA, rispettivamente. Tali approcci sono estremamente utili per testare la funzionalità dei lncRNA in un modo high throughput.

Una volta identificati i lncRNA specifici, le tecnologie che possono definire la struttura del lncRNA in vivo sono fondamentali per determinare i moduli lncRNA e i domini strutturali. La determinazione della struttura dell’RNA può essere accoppiata con l’analisi genomica comparativa che prenderà in considerazione la conservazione posizionale e il fatto che gli lncRNA possono basarsi su elementi brevi piuttosto che su lunghi tratti di sequenze conservate. Gli studi genetici che possono mirare precisamente a questi domini strutturali mantenendo l’espressione dell’lncRNA (Matsumoto et al., 2017) delineeranno l’impatto funzionale di questi motivi. L’uso dell’editing genico CRISPR/Cas9 in cellule staminali pluripotenti indotte che possono essere espanse clonalmente, ingegnerizzate per ospitare delezioni definite dei motivi strutturali e differenziate in altri tipi di cellule (Cochrane et al., 2017; Granata et al., 2017) può fornire prove definitive dell’impatto funzionale di questi domini nel sistema cardiovascolare. Il potenziale di questi elementi come nuovi bersagli potrebbe essere esplorato ulteriormente per interventi precisi adatti ad applicazioni terapeutiche.

Contributi degli autori

AZ ha iniziato lo studio, progettato la sua struttura e scritto il manoscritto. AA ha fornito consigli concettuali e ha rivisto il manoscritto. KS ha progettato la struttura dello studio, ha fornito consigli concettuali e ha rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione presentata.

Finanziamento

Questo lavoro è stato finanziato dalla British Heart Foundation. AZ è un Intermediate Fellow della British Heart Foundation (FS/13/18/30207).

Conflict of Interest Statement

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.