F-actin

Crystal Structure of F-actin, 2zwh

Le unità di actina filamentosa (F-actin) sono anche chiamate microfilamenti e sono componenti proteiche altamente conservate che si trovano quasi ubiquitariamente nei citoscheletri eucariotici. La F-actina e altre proteine di actina hanno generalmente ruoli strutturali nelle cellule.

Introduzione

L’actina si trova in quasi tutte le cellule eucariotiche ed è conosciuta principalmente per la sua funzione di proteina strutturale e di traslocazione. Ha anche una funzione di ATPasi, poiché idrolizza l’ATP in ADP e Pi e subisce cambiamenti conformazionali ad ogni idrolisi. L’actina appartiene alla superfamiglia dell’actina, che include altre proteine come Hsp70(DnaK), Hsc70, ed esochinasi, a causa del suo cambiamento conformazionale dipendente dal nucleotide. A causa della somiglianza osservata in Escherichia Coli, Hsc70 e il dominio ATPasi dell’actina, si ritiene che le due proteine abbiano un’ascendenza comune. I procarioti non sono noti per avere l’actina, ma hanno comunque un omologo dell’actina, MreB, che porta anche all’idea di una possibile ascendenza comune.

L’actina si presenta in due forme: l’actina globulare (G-actin), le unità monomeriche libere di actina, e l’actina filamentosa (F-actin) che è la forma polimerica. Queste due forme esistono in un equilibrio dinamico l’una con l’altra poiché la polimerizzazione e la depolimerizzazione associate all’ATP avvengono continuamente all’interno della cellula. Le unità monomeriche nella F-actina possiedono una forma che è distinta dalla forma monomerica libera ed è un risultato di questo cambiamento che l’attività ATPasi più specifica può essere osservata.

Assemblea

(1J6Z).

G-actina è la forma monomerica libera di actina che polimerizza in F-actina. Le strutture dell’actina globulare e filamentosa sono distinte l’una dall’altra in numerosi modi, nonostante il fatto che la G-actina comprenda la F-actina. Quando l’actina monomerica viene polimerizzata in F-actina, l’unità diventa appiattita. Inoltre, la F-actina possiede una funzione ATPasi che è minima nella G-actina. I domini e il sito attivo sono gli stessi in termini di componenti costitutivi e saranno discussi in seguito in termini di monomero F-actina.

G-actina sembra avere più ligandi nella sua struttura, esterni al sito attivo. Si ritiene che solo 3 dei 5 esistano effettivamente in soluzione e che contribuiscano alla polimerizzazione di G-actina in F-actina. Questa rappresentazione di G-actina possiede anche un che si osserva in alcune strutture cristalline di actina, ma non necessariamente. La molecola osservata su Cys374, è stata usata per bloccare l’attività di polimerizzazione in modo da poter osservare il cristallo di G-actina

La formazione di F-actina è un processo dinamico di assemblaggio e disassemblaggio che è stato definito “treadmilling”. La transizione tra G e F-actina inizia con un oligomero stabilizzato di unità di ATP-actina formato attraverso uno schema di piegatura di tipo nucleazione-condensazione. L’aggiunta di unità ATP-monomeriche ad entrambe le estremità si verifica successivamente, tuttavia, a causa di una differenza di polarità di carica nelle due estremità, c’è un’aggiunta preferenziale a quella che viene definita “estremità più (+)” o “estremità spinata”. All’estremità opposta, la “estremità negativa (-)” o “estremità appuntita”, c’è una dissociazione preferenziale delle unità di actina.

Dopo l’attaccamento dell’actina legata all’ATP, si verifica l’idrolisi dell’ATP che produce lo stato di ADP e Pi legato. La successiva perdita di un Pi lascia lo stato di ADP-actina. A causa del potenziale di aggiunta o rimozione di unità monomeriche che si verifica ad entrambe le estremità, l’assemblaggio della F-actina può essere descritto in termini di equilibrio. Tuttavia, poiché il tasso di associazione ATP-actina è dieci volte superiore a quello della dissociazione ADP-actina, la f-actina ha l’aspetto di muoversi in avanti, o “treadmilling”. I monomeri di ADP-actina si dissociano all’estremità negativa e vengono riciclati in ATP-actina in modo che la polimerizzazione all’estremità positiva possa avvenire di nuovo.

Struttura

Storia della struttura

La proteina F-actina fu scoperta da Straub nel 1942. La struttura è stata ipotizzata sulla base di una cristallografia a raggi X a bassa risoluzione trovata nel 1990 da Holmes et al. e in questo periodo, il “modello Holmes” è stato accettato. Al contrario, la struttura della G-actina è stata determinata indipendentemente più di 30 volte. Un modello di F-actina a più alta risoluzione è stato depositato solo recentemente nella banca dati PDB nel dicembre 2008 da Oda et al.

F-actina monomero e polimero

(2zwh)

Monomero

Ogni unità monomerica di F-actina ha, come parte della sua struttura terziaria, diversi loop che sono importanti per il suo montaggio alla F-actina polimerica. Questi anelli subiscono cambiamenti conformazionali in base allo stato del nucleotide legato o servono come regioni per le unità monomeriche di actina adiacenti a cui legarsi. Agiscono come un “interruttore” per le conformazioni, in base al nucleotide legato. I residui del DNAse I-binding loop (40-50), oltre a subire cambiamenti conformazionali che hanno un impatto sulla stabilità, legano gli enzimi DNAse I e si suppone che mantengano una presa sul DNAse I. Il loop idrofobico, che attraversa i residui 264-273, e il , che attraversa i residui 165-172, funzionano come siti a cui possono legarsi i D-loop monomerici di actina adiacenti. Una funzione simile si nota per i residui (374-375).

La molecola di F-actina come mostrato qui consiste di 375 residui (43kDa) e due ligandi, ADP e Ca2+. Ha due domini principali separati da una fessura di legame al nucleotide. A seconda dello stato del nucleotide legato, la conformazione più stabile della F-actina cambia. Nei suoi stati legati al nucleotide ATP e ADP + Pi, ha una fessura di legame chiusa. Nel suo stato legato solo all’ADP, ha una fessura di legame più ampia. Un tratto caratteristico dell’actina è che i domini rimangono contorti l’uno rispetto all’altro, nonostante i cambiamenti conformazionali dipendenti dallo stato del nucleotide.

Polimero F-Actina (basato sulla struttura della F-actina di Ken Holmes)

Polimero

La F-actina ha l’aspetto di due eliche destre, con una graduale torsione l’una intorno all’altra. In realtà è composta da ripetizioni di 13 unità di actina ogni 6 giri a sinistra, per una lunghezza di 350 Å.

Cambiamenti conformazionali dipendenti dallo stato del nucleotide

Lo stato del nucleotide fosforilato legato influenza la conformazione che il monomero F-actina assume. La presenza di un gamma-fosfato nel sito attivo causa la rotazione di un residuo Ser14. Questo cambiamento porta allo spostamento di un’istidina metilata (HIC73), che altera il sito attivo della F-actina e causa un cambiamento conformazionale nel D-loop. L’HIC73 si trova nel “sensor loop”, o “interruttore” per collegare i cambiamenti del nucleotide legato ai cambiamenti conformazionali. In ATP-actina e ADP-Pi-actina, il D-loop non è strutturato. Nella forma di F-actina legata all’ADP, un’alfa-elica è comunemente evidente nel D-loop del monomero.

Anche se l’alfa-elica non è osservata in questo modello di F-actina di Oda e non è vista in alcuni altri studi sulla F-actina, è riconosciuto da Oda et. al che i risultati sperimentali potrebbero aver portato a un’alfa-elica estesa nel modello, al contrario di un filamento disordinato esteso come segmento di interazione tra unità monomeriche di F-actina.

Domini

(2zwh)

La struttura di una singola unità di F-actina nasce da una catena polipeptidica con due domini. La fessura di legame del nucleotide, sito di idrolisi dell’ATP, può essere osservata tra i due domini. Il movimento dei domini permette le conformazioni aperte e chiuse della F-actina.

Il movimento dei domini è reso possibile dalla rotazione intorno al , mostrato in viola. Secondo Oda et al., durante la transizione da G- a F- actina, si ritiene che il dominio 2 si inclini di 20° e si adatti al dominio 1, dando così una conformazione più piatta rispetto alla G-actina libera. Non è certo se questo appiattimento avviene prima o dopo l’idrolisi dell’ATP. Holmes fornisce un’immagine semplificata di questo movimento del dominio e dell’appiattimento.

Stabilità

La forma appiattita piegata della F-actina richiede diversi meccanismi di stabilizzazione rispetto alla forma monomerica libera della G-actina. La stabilità del complesso F-actina è raggiunta da una serie di coinvolgimenti di arginina 206, 183, 177 (viola); glutammato 72 (blu), aspartato 187 (verde), 179 e 4-metil istidina 73 (giallo). Si ritiene che l’ulteriore stabilità derivi da una rottura dell’interazione tra i residui nella stessa metà dei rispettivi domini per una nuova interazione tra cui si osserva una distanza molto maggiore tra loro.

Una volta che il Pi viene rilasciato, un cambiamento conformazionale sul D-loop risulta nel “rammollimento” del filamento di F-actina. Cioè, rende il monomero di ADP-actina più instabile e lo rende più suscettibile alla scissione

Sito Attivo

Con il legame dell’actina sull’estremità più del filamento di actina, la funzione ATPasi viene attivata. Il cambiamento conformazionale da G- a F- actina promuove l’attività catalitica a causa dello spostamento di 20° che porta ad un sito di legame più chiuso; questo cambiamento conformazionale è stabilizzato anche dall’interazione diagonale del sottodominio tra Leu110 e Thr194. Come risultato di questi cambiamenti conformazionali, l’actina è spostata più vicino al ligando ATP-Ca2+. Gln137 trattiene una molecola d’acqua, e mettendola in prossimità dell’ATP permette la scissione del gamma-fosfato. Il rilascio del fosfato inorganico avviene attraverso il cambiamento conformazionale del flessibile “D-loop” in un’alfa-elica ordinata (anche se non dimostrato da questo modello).

Funzione

F-actina svolge un ruolo strutturale, meccanico ed enzimatico nelle cellule eucariotiche. Queste funzioni non sono necessariamente esclusive l’una dell’altra.

Le funzioni dinamiche della f-actina sono fortemente coinvolte nella migrazione cellulare.

Citoscheletro

La f-actina è il componente più abbondante del citoscheletro degli eucarioti. Fornisce grandi quantità di resistenza alla trazione, considerando le sue dimensioni sottili. Nei casi in cui la flessibilità non è desiderabile come componente strutturale, i reticoli possono essere formati tra i polimeri di F-actina per dare maggiore rigidità e supporto.

Il prolungamento dei rami di F-actina porta al fenomeno della spinta della membrana plasmatica in avanti nell’estensione lamellopodiale e filopodiale. Questo processo si basa sullo stato di equilibrio dinamico in cui esistono G e F-actina, poiché è la continua polimerizzazione delle unità di actina sul bordo anteriore che spinge l’estensione della membrana. Senza la funzione di ATPasi enzimatica della F-actina, questo processo non sarebbe possibile.

Actina-Miosina

La forma relativamente più piatta della F-actina rispetto alla G-actina permette alla miosina di legare preferenzialmente la F-actina alla G-actina. Questo significa che la F-actina, non la G-actina, è la forma funzionale dell’actina. Essa compone gran parte dei filamenti sottili insieme alla miosina per dare le contrazioni muscolari. La struttura della F-actina le conferisce una grande resistenza a forze estese, come quelle sperimentate nella contrazione muscolare.