EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

Overview of EzColocalization workflow

Il flusso di lavoro per EzColocalization è diviso in quattro moduli, ognuno con una propria scheda sulla GUI. Le schede sono: (i) “Inputs” dove vengono selezionate e allineate immagini, maschere o liste di regioni di interesse (ROI); (ii) “Cell Filters” dove le cellule possono essere selezionate in base alle caratteristiche fisiche e all’intensità del segnale; (iii) “Visualization” dove vengono create mappe di calore, scatterplot e matrici metriche (definite di seguito); e (iv) “Analysis” dove vengono scelte le metriche e gli output di colocalizzazione. Non tutti i moduli e non tutti i processi all’interno di un modulo devono essere utilizzati. Alcune schede hanno un pulsante “Preview” per eseguire un modulo specifico invece del pulsante “Analyze” che esegue tutti i processi selezionati in tutti i moduli.

Inputs

I file immagine, che sono scelti nella scheda “Inputs” (Fig. 1A), devono essere: (i) monocromatici (cioè non in formato RGB o CMYK); (ii) a 8-bit, 16-bit, o 32-bit; e (iii) in un formato come TIFF che mantiene i valori originali di intensità dei pixel. Le immagini di grandi dimensioni possono essere compresse per il trasferimento di file utilizzando un formato senza perdita di dati come ZIP o LZW, e poi decompresse per le analisi. Oltre alle immagini, EzColocalization può accettare maschere e liste ROI per l’identificazione delle cellule (vedi sotto). Se ci sono più immagini per ogni canale, le immagini dovrebbero essere impilati per l’analisi più efficiente nel menu “Stack” (vedi guida ImageJ per ulteriori dettagli24). Le immagini in una pila possono essere diversi campi di vista o una serie temporale, ma devono avere le stesse dimensioni, ingrandimento e ordine di immagine per ogni canale. La scheda di input fornisce anche opzioni per l’impostazione di soglie per l’intensità del segnale e l’allineamento di immagini disallineate da diversi canali (Fig. 1B e informazioni supplementari). Raccomandazioni per l’acquisizione di immagini adatte per l’analisi di colocalizzazione sono forniti nelle informazioni supplementari. Nota: allineamento opera sul presupposto che una soglia appropriata per l’intensità del segnale può essere scelto per distinguere i pixel all’interno e all’esterno delle cellule, se la soglia comprende aree al di fuori della cella o solo una zona limitata all’interno delle cellule, quindi l’allineamento potrebbe non funzionare correttamente. Per questo motivo, tutti gli allineamenti dovrebbero essere controllati visivamente esaminando le ROI per confermare che le aree cellulari appropriate sono selezionate.

EzColocalization è progettato principalmente per un canale “identificazione delle cellule” e due o tre immagini del canale “reporter”. Tuttavia, può funzionare con altre combinazioni di input (Tabella S1). Il canale di identificazione delle cellule è utilizzato per identificare le singole cellule, e di conseguenza per distinguere i pixel intracellulari ed extracellulari. Il canale di identificazione delle cellule può essere qualsiasi tipo di immagine che permette l’identificazione dei confini delle cellule tra cui: immagini di microscopia leggera (ad esempio contrasto di fase 25,26 e campo chiaro), le immagini con un reporter che etichetta la membrana cellulare o che è in tutto il citoplasma (ad esempio Cy5, Fig. 1B), e le immagini con un colorante extracellulare che delinea le cellule. Differenziale interferenza contrasto (DIC) immagini creare ombre che rendono difficile per la selezione automatica delle cellule utilizzando metodi di soglia 27; Pertanto, per le immagini DIC si consiglia di creare ROI utilizzando gli “strumenti di selezione” in ImageJ per delineare manualmente aree cellulari, e poi aggiungendoli ad un elenco scegliendo “Aggiungi al Manager” (in “Selezione” sottomenu del menu “Modifica”). Una volta selezionate le ROI per tutte le cellule di interesse in un’immagine, una maschera binaria può essere creata utilizzando le funzioni “Clear Outside” e “Autothreshold” di ImageJ.

Cell Filters

La scheda “Cell Filters” è usata per aiutare a selezionare le cellule nelle immagini (Fig. 2A) e distinguere i pixel intracellulari ed extracellulari. Le cellule sono identificate da: (i) scegliendo uno degli algoritmi di soglia di ImageJ24, o selezionando manualmente le soglie (il che avviene selezionando “*Manual*” da un elenco a discesa nella scheda Inputs e premendo il pulsante “Show threshold(s)”), per identificare le regioni corrispondenti alle cellule nel canale di identificazione delle cellule (Fig. 2B); (ii) utilizzando la segmentazione a spartiacque per separare gli oggetti toccanti nelle immagini del canale di identificazione delle cellule (opzionale) (Fig. 2B); (iii) selezionando gli oggetti dalle immagini del canale di identificazione delle cellule in base a parametri fisici (Fig. 2C) e all’intensità del segnale (Fig. 2D). EzColocalization tenterà di rilevare automaticamente se le immagini di input hanno uno sfondo scuro o chiaro usando l’asimmetria. Supponendo che ci siano più pixel nello sfondo che nelle cellule, un’immagine con skewness positiva indica uno sfondo scuro e uno skewness negativo indica uno sfondo chiaro. Gli utenti possono anche selezionare manualmente se le immagini di input hanno uno sfondo scuro o chiaro nelle opzioni “Parametri…” del menu “Impostazioni”. Le celle che sono solo parzialmente all’interno di un’immagine, e che quindi potrebbero fornire valori fuorvianti, vengono automaticamente rimosse dalle analisi.

EzColocalization ha un “filtro pre-watershed” opzionale e otto filtri post-watershed opzionali (con la possibilità di selezionarne altri). La segmentazione a spartiacque può aiutare la separazione delle cellule che si dividono e si toccano28 , ma può anche dividere grandi oggetti come gli aggregati di materiale extracellulare in frammenti più piccoli che hanno le stesse dimensioni delle cellule. Per evitare quest’ultimo caso, il filtro Pre-watershed può essere utilizzato per escludere dall’analisi oggetti con grandi aree. Il pulsante Preview nella scheda Cell Filters permette agli utenti di vedere quali oggetti sull’immagine corrente saranno selezionati quando i limiti minimi e massimi di tutti i filtri sono regolati. Ci sono due classi di parametri per i filtri di cella post-watershed (Tabella S2): (i) parametri fisici basati su misure dal canale di identificazione delle cellule; e (ii) parametri di intensità del segnale dai canali reporter. I parametri fisici si applicano a tutti i canali mentre i parametri di intensità del segnale si applicano solo al canale reporter per il quale sono selezionati (perché i reporter possono avere livelli molto diversi di segnale). Oltre al filtraggio basato sulle opzioni predefinite in ImageJ, EzColocalization ha filtri per il “MeanBgndRatio” o “MedianBgndRatio”, che sono calcolati dividendo l’intensità media o mediana del segnale dei pixel all’interno di un oggetto per la rispettiva intensità media o mediana dei pixel extracellulari.

Visualizzazione

La scheda “Visualizzazione” visualizza i segnali o le metriche nelle cellule come: (i) “mappe di calore”; (ii) scatterplot; e (iii) “matrici metriche” (Fig. 3A).

Le mappe di calore sono immagini pseudocolore che mostrano la grandezza relativa dei segnali reporter (Fig. 3B). Essi sono generati da normalizzazione e ridimensionamento in modo che i valori minimi e massimi dei pixel sono 0 e 255 rispettivamente in ogni cella, immagine o stack. Ci sono otto opzioni per colorare le mappe di calore, e i valori di intensità per ogni colore sono ottenuti dalla funzione “Mostra LUT” (all’interno del sottomenu “Colore” del menu “Immagine” in ImageJ). Le mappe di calore delle cellule sono adatte per determinare dove ogni reporter si presenta con la massima intensità nelle cellule. Mappe di calore immagine può mostrare se diverse cellule all’interno di un campo di vista hanno intensità sostanzialmente diverse, che può indicare eterogeneità biologica o disomogeneità di etichettatura. Stack mappe di calore può mostrare se le cellule in diverse immagini hanno livelli sostanzialmente diversi di intensità del segnale, che può indicare disomogeneità in etichettatura o misurazioni attraverso una diapositiva (ad esempio a causa di photobleaching) o cambiamenti nel segnale nel tempo (se lo stack è una serie temporale). Nota: le apparenze mappa di calore sono influenzati dalla luminosità e le impostazioni di contrasto.

I plot di dispersione mostrano il rapporto tra l’intensità del segnale per due o tre canali reporter per le singole cellule e immagini (Fig. 3C). Questo rapporto è importante nella scelta della metrica appropriata colocalizzazione (Informazioni supplementari). Scatterplot può anche rivelare eterogeneità nei modelli di localizzazione 8, che può richiedere la rimozione dei pixel di sfondo o analisi separate per i diversi tipi di cellule.

Matrici metriche forniscono una panoramica dei modelli di localizzazione, mostrando i valori calcolati di una metrica colocalizzazione per molte combinazioni di soglia. Matrici metriche per il punteggio di sovrapposizione soglia (TOS) hanno dimostrato di essere utile per l’analisi dei modelli di localizzazione per due canali reporter 8,15 (Fig. 3D). Per completezza, EzColocalization ha la possibilità di calcolare matrici metriche per due canali reporter utilizzando cinque altre metriche: punteggio di sovrapposizione soglia con scala logaritmica 8, coefficiente di correlazione Pearson (PCC), Manders ‘coefficienti di colocalizzazione (M1 e M2), coefficiente di correlazione rango di Spearman (SRCC), e quoziente di correlazione intensità (ICQ) 8,15. Colocalizzazione per tre canali può anche essere misurata utilizzando ICQ, coefficienti di colocalizzazione di Manders e TOS29 (informazioni supplementari).

Soglie per tutte le metriche sono misurati come il percentile superiore (FT) di pixel per intensità del segnale 8,15. Per esempio, FT = 0,1 è il 10% dei pixel con il segnale più alto. Per le matrici metriche, FT viene utilizzato anche per specificare la dimensione del passo per le combinazioni di soglia. Cioè, FT = 0,1 seleziona anche le soglie per il 10%, 20%, …, e 100% dei pixel con il segnale più alto. Se FT non divide uniformemente in 100, allora la percentuale rimanente è l’ultima dimensione del passo. Per le metriche che non hanno bisogno di una soglia (cioè PCC, SRCC e ICQ) i valori sono calcolati assumendo che esistano solo i pixel sopra le soglie. La finestra della matrice metrica ha opzioni per salvare i risultati come testo o immagine, per cambiare il FT o il tipo di metrica, per visualizzare i valori delle metriche delle singole celle come elenco e per calcolare la media, la mediana o la modalità della metrica per ogni combinazione di soglie. Il pulsante “Proc” (elaborato) e “Raw” determina se l’elenco dei dati visualizzati, copiati o salvati con i pulsanti “List”, “Copy” o “Save…” è rispettivamente il valore medio per il campione per ogni combinazione di soglie (ad esempio il valore mediano) o tutti i valori per ogni cella nel campione per tutte le combinazioni di soglie.

Analysis

La scheda “Analysis” ha tre sottotabelle (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” e “Custom”). La sottotabella “Analysis Metrics” ha sei metriche per misurare la colocalizzazione per due reporter (Fig. 4A) e tre metriche per tre reporter (vedi sezione precedente). Gli utenti possono scegliere una soglia o nessuna soglia per PCC, SRCC e ICQ. I coefficienti di colocalizzazione di TOS e Manders devono avere una soglia per essere calcolati. La sottotabella Metrics Info contiene informazioni e risorse sulle metriche utilizzate nella sottotabella Analysis Metrics (maggiori dettagli nella sezione Supplementary Information). Le soglie possono essere selezionate usando il metodo di Costes30 o manualmente. Nella sottotabella Custom (vedi Informazioni supplementari per ulteriori informazioni), gli utenti possono scrivere il proprio codice in JavaTM per analizzare le immagini (nota: l’esempio fornito è per il calcolo del PCC) (Fig. 4B). Il pulsante “Compile” testa il codice e crea un file temporaneo nella directory temporanea Java e visualizza il risultato della compilazione con un’etichetta “Sucesso” o “Fallito”. In caso di successo, il codice personalizzato compilato viene letto nuovamente in memoria e applicato alle celle selezionate.

L’output di ogni analisi è una tabella che specifica l’immagine e un numero identificativo per ogni cella (Fig. 4C), e per ogni cella, vengono forniti i valori per: (i) la metrica selezionata; (ii) i parametri fisici; e (iii) l’intensità media del segnale per ogni canale (se selezionato). Nota: “NaN” nella tabella di output indica il fallimento del calcolo di un valore. Gli utenti possono anche generare finestre di riepilogo (con il numero di cellule, la media, la mediana e la deviazione standard per la metrica selezionata) (Fig. 4D), gli istogrammi dei valori della metrica (Fig. 4E), le immagini della maschera binaria e un elenco di ROI che rappresentano la posizione di ogni cella e il numero su ogni immagine nel ROI manager. Gli elenchi di ROI e le immagini della maschera binaria possono essere salvati per la ri-analisi delle stesse cellule.

Applicazioni di EzColocalization

EzColocalization è progettato per essere utilizzato in modo modulare per facilitare la personalizzazione delle analisi per una grande varietà di esperimenti e di esigenze dei ricercatori. Questa sezione si concentra sulla dimostrazione di strumenti specifici in EzColocalization per risolvere problemi del mondo reale in diversi set di immagini.

Nella prima applicazione di EzColocalization, immagini di neuroni ippocampali di ratto dalla Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, che sono attribuite a Dieter Brandner e Ginger Withers) sono utilizzate per dimostrare: (i) l’uso di un canale reporter per l’identificazione delle cellule quando un esperimento non ha immagini separate non-reporter per l’identificazione delle cellule; (ii) i filtri delle cellule per selezionare le cellule; e (iii) gli strumenti di visualizzazione per scegliere le metriche. Il flusso di lavoro dell’analisi è delineato in Fig. 5A. Nella prima fase, due pile di immagini reporter sono stati creati: una pila con le immagini dove F-actina è etichettato (utilizzando un peptide falloidina coniugato a rodamina), e la seconda pila con le immagini dove la tubulina è etichettato (utilizzando un anticorpo coniugato ad Alexa 488) (Fig. 5B). L’interazione di F-actina e tubulina è importante per la crescita e la migrazione dei neuroni31,32. Abbiamo usato le immagini di F-actina per l’identificazione delle cellule perché è presente in tutte le cellule e mostra i confini delle cellule8. Singole cellule sono state selezionate dalle immagini F-actina applicando una soglia per identificare le cellule24 e utilizzando un filtro cellulare per rimuovere i detriti delle cellule (nota: valori dei parametri in Fig. 5A).

Dopo che le cellule sono state selezionate, l’intensità dei segnali reporter sono stati esaminati utilizzando mappe di calore cellulare e scatterplot. Abbiamo trovato i reporter non colocalizzare ad alti livelli di segnale e c’era un rapporto complesso tra le intensità del segnale (Fig. 5C,D). A causa di quest’ultimo, la localizzazione è stata quantificata utilizzando Manders ‘M1 e M2 e TOS (Informazioni supplementari). M1 e M2 sono stati valutati a soglie selezionate dal metodo di Costes per la cella delineata in Fig. 5B, e i valori erano 0.289 e 0.995 rispettivamente. Questi valori sono solitamente interpretati come indicanti che la tubulina ha un’alta colocalizzazione con la F-actina, e la F-actina ha una bassa colocalizzazione con la tubulina. I valori di TOS sono stati valutati generando una matrice metrica con i valori mediani di TOS. La matrice ha mostrato colocalizzazione, anticolocalizzazione e non colocalizzazione a diverse soglie per le intensità di segnale di tubulina e F-actina (Fig. 5E). Nei siti delle cellule in cui F-actina e tubulina hanno la più alta intensità di segnale (top 10% dei pixel per ogni canale), il valore mediano TOS è -0,36 (n = 20). Questo valore negativo indica anticolocalizzazione, che è coerente con l’impressione ottenuta dalle mappe di calore e scatterplot, e con altri rapporti 8.

Nella seconda applicazione, immagini di Saccharomyces cerevisiae in fase di mitosi sono state ottenute dalla Cell Image Library33 per dimostrare: (i) l’identificazione delle cellule attraverso i contorni disegnati a mano (per gli esperimenti in cui i metodi automatici di identificazione delle cellule non possono essere applicati); e (ii) l’allineamento delle immagini. Gli ingressi reporter erano un’immagine da un ceppo wild type (“controllo”; CIL: 13871) che ha la proteina BFA1 che carica TEM1 sul corpo del polo del fuso, e un’immagine da un ceppo senza la proteina BFA1 (∆bfa1 deletion mutant; CIL: 13870). In queste immagini reporter, le cellule hanno espresso la proteina TEM1 fusa a GFP e il DNA è stato etichettato con DAPI (4′, 6-diamidino-2-fenilindolo). TEM1 localizza ai corpi del polo del fuso durante la mitosi ed è implicato nell’attivazione dell’uscita dalla mitosi33. Il flusso di lavoro è mostrato in Fig. 6A. In questa applicazione, ROI sono stati disegnati manualmente intorno alle cellule utilizzando lo strumento di selezione “Freehand” in ImageJ su immagini DIC. Maschere binarie, che sono stati utilizzati per selezionare le aree delle cellule, sono stati creati selezionando le ROI e utilizzando il “Clear Outside” e poi “Auto Threshold” funzioni di ImageJ24 (Fig. 6B). Le aree cellulari sono stati utilizzati per l’identificazione delle cellule e per correggere l’allineamento tra le immagini DIC e dei canali reporter utilizzando l’algoritmo di soglia “Default” (Fig. 6C). Dopo questa identificazione delle cellule e l’allineamento delle immagini, le immagini sono ora pronti per la visualizzazione e l’analisi come descritto nell’esempio precedente.

Nella terza applicazione, le immagini di interi adulti Caenorhabditis elegans ottenuti dal Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC012v1, M14)34 sono stati utilizzati per dimostrare che: (i) EzColocalization può analizzare la colocalizzazione in organismi interi; e (ii) i filtri “cella” possono selezionare i singoli organismi in base all’intensità del segnale del reporter. Le immagini in questo esempio sono dallo stesso set di dati utilizzati nel nostro studio che descrive TOS (ma non sono le stesse immagini) 8. Il flusso di lavoro è mostrato in Fig. 7A. Contorni di singoli C. elegans sono stati disegnati in ImageJ su immagini bright-field per creare ROI, e le ROI sono stati aggiunti al gestore ROI per l’identificazione “cella”. GFP espresso dal promotore clec-60 nell’intestino anteriore era reporter 1 e mCherry espresso dal promotore myo-2 all’interno della faringe, che è un organo vicino all’intestino anteriore 35, era reporter 2. I filtri delle cellule per i parametri fisici non erano necessari perché solo gli oggetti considerati adatti C. elegans aveva contorni disegnati intorno a loro in primo luogo. Tuttavia, i filtri delle cellule per l’intensità del segnale sono stati necessari perché alcuni C. elegans aveva basso segnale GFP, forse a causa di silenziamento del transgene 36,37 (Fig. 7B). Visualizzazione successiva e l’analisi può essere eseguita come descritto nella prima applicazione.

Nella quarta applicazione, dimostriamo l’analisi di colocalizzazione per tre canali reporter. Il flusso di lavoro è stato lo stesso come per due canali reporter tranne “3 canali reporter” è stato prima selezionato nel menu principale “Impostazioni” (Fig. 8A). Le immagini sono state ottenute dal Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, versione 1, set di immagini: 37983, immagine: p23_s9) di cellule tumorali ossee U2OS (n = 66) 38. Le tre immagini reporter avevano DNA, reticolo endoplasmatico (ER) e mitocondri rispettivamente colorati con Hoechst 33342, concanavalin A / Alexa Fluor488 coniugato, e MitoTracker Deep Red (riga superiore, Fig. 8B). Identificazione delle cellule è stata eseguita con un’immagine della membrana plasmatica etichettata con agglutinina di germe di grano (WGA)/Alexa Fluor 555 coniugato (in alto a sinistra, Fig. 8B). Nota: l’immagine aveva anche l’apparato di Golgi e F-actina rete etichettato 38. La membrana plasmatica è stato tracciato utilizzando lo strumento di selezione poligono in ImageJ per creare ROI per le singole cellule, e il gestore ROI contenente le ROI è stato selezionato per l’identificazione delle cellule.

I modelli di localizzazione sono stati visualizzati nello stesso modo come per due reporter tranne che: (i) ci sono tre serie di mappe di calore per i reporter invece di due (riga inferiore, Fig. 8B), e (ii) scatterplot e matrici metriche sono in tre dimensioni (Fig. 8C-F). C’è l’opzione nella scheda Visualization e nella scheda Analysis (Fig. 8G) per misurare la colocalizzazione per i tre reporter usando ICQ, TOS o le metriche M1, M2 e M3 di Manders. Delle tre metriche, abbiamo trovato che TOS era la più facile da interpretare. TOS ha un unico valore per misurare la colocalizzazione di tutti e tre i segnali reporter, e ha mostrato chiaramente i segnali reporter per il nucleo, mitocondri e ER sovrapposto a soglie basse (cioè ad alti valori FT c’è colocalizzazione; colore rosso in Fig. 8E) e non si sovrappongono a soglie elevate (cioè a bassi valori FT c’è anticolocalizzazione; colore blu in Fig. 8E). Queste osservazioni sono coerenti con il nucleo, mitocondri e organelli ER sovrapposti ai loro bordi (dove il segnale da loro reporter è tipicamente inferiore) a causa di interazioni fisiche conosciute, ma non ai loro centri (dove il segnale da loro reporter è tipicamente superiore) perché sono strutture distinte in cellule39,40,41.

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