Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation (ERAD)

2.1 Processo di ripiegamento delle proteine e riconoscimento delle proteine mal ripiegate

Circa il 30% delle proteine totali e tutte le proteine transmembrana della cellula sono sintetizzate nell’ER, che funge da portale di ingresso nella via secretoria attraverso il canale Sec61 . Come essere traslocato, la sequenza di segnale idrofobico terminale N della proteina appena sintetizzata è scisso da un complesso di peptidasi. Le modifiche co- e post-translazionali come la formazione di legami disolfuro, le fasi iniziali della N-glicosilazione e l’ancoraggio del glicofosfatidilinositolo (GPI) avvengono nell’ER.

L’ambiente ossidante dell’ER aiuta la formazione di legami disolfuro, che stabilizza la struttura terziaria delle proteine e facilita l’assemblaggio delle proteine. Durante il processo di piegatura, i legami disolfuro si formano attraverso l’ossidazione di coppie di tioli liberi sui residui di cisteina da parte delle isomerasi del disolfuro di proteina (PDI). Le PDI agiscono come cicli, e dopo l’ossidazione iniziale, i legami disolfuro sono talvolta isomerizzati dalle PDI e da ERp57, che è una tiolo ossidoreduttasi, al fine di stabilizzare il corretto ripiegamento delle proteine. Al contrario, la riduzione dei legami disolfuro delle proteine mal ripiegate è necessaria per la fase di retrotraslocazione di ERAD. Infatti, PDI permette la retrotraslocazione del simian virüs-40 (SV-40) e della tossina del colera. ERdj5, un’ossidoreduttasi ER, riduce i legami disolfuro e interagisce con EDEM (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein) e accelera anche la fase di retrotraslocazione di SV-40 . ERDJ5 regola anche la degradazione della variante α1-antitripsina che causa la malattia (null Hong Kong).

Il ripiegamento è aiutato da chaperoni molecolari che proteggono dal misfolding e unfolding. Gli chaperoni si legano agli N-glicani giocando un ruolo cruciale nel ripiegamento e nella degradazione delle proteine. È evidente che la N-glicosilazione, il controllo di qualità del ripiegamento delle proteine e l’ERAD sono funzionalmente collegati. Dopo l’ingresso nell’ER, una grande maggioranza della catena polipeptidica appena sintetizzata viene glicosilata con legami N. L’enzima oligosaccariltransferasi riconosce la sequenza di consenso Asn-X-Ser/Thr nella maggior parte della molecola proteica nascente e integra covalentemente alla proteina un alto mannosio contenente gruppi glicani di base (Glc3Man9GlcNAc2) dal dolichol localizzato sulla membrana ER. A causa dell’emivita molto breve della forma triglicosilata dell’oligosaccaride legato alla proteina, l’elaborazione del glicano inizia immediatamente dopo il trasferimento dei gruppi precursori del glicano attraverso gli enzimi glucosidasi. In seguito alla scissione di due dei tre residui di glucosio, la proteina nascente potrebbe interagire con le lectine di controllo qualità come CNX e CLR. Questa interazione è conservata fino alla scissione del residuo di glucosio rimanente. Dopo aver rilasciato la glicoproteina dal ciclo CNX/CLR, anche il glucosio finale viene tagliato creando un substrato non glicosilato. Questo compromette l’interazione del substrato con i chaperon della lectina. In questa fase, se la proteina è piegata correttamente, potrebbe uscire dall’ER per la sua destinazione finale. Tuttavia, se la glicoproteina è ancora spiegata, viene trattenuta nell’ER e riglucosilata dall’UDP-glucosio:glicoproteina glucosiltransferasi e rimbalza con CNX e CLR dando alla proteina più tempo per il corretto ripiegamento. Non è ancora compreso il meccanismo coinvolto nella terminazione dei cicli di reglicosilazione/deglicosilazione. Tuttavia, è chiaro che, se la catena polipeptidica non può raggiungere la sua forma matura dopo ripetuti tentativi di ripiegamento, i residui terminali di mannosio dalla catena glicanica centrale vengono gradualmente rimossi dalla ER α1,2-mannosidasi I (ERMan1). ERMan1 produce l’isomero Man8GlcNAc2 rimuovendo un residuo di mannosio dal ramo centrale degli N-glicani. Con questo trimming, le glicoproteine diventano substrati più poveri per la reglicosilazione e l’uscita dal ciclo CNX.

Le patch idrofobiche delle proteine correttamente piegate sono solitamente sepolte all’interno delle proteine solubili. Tuttavia, queste patch potrebbero essere esposte nelle proteine mal ripiegate. Se una proteina ha superfici idrofobiche esposte, BiP si lega ad essa per nascondere queste superfici soggette ad aggregazione per tentativi di ripiegamento corretti, impedendo l’aggregazione. Tuttavia, se il ripiegamento non riesce o viene ritardato, l’interazione estesa chaperone-proteina mal ripiegata serve per un processo sofisticato in cui la proteina viene trasferita ad altri chaperoni e/o al processo ERAD.

È ben accettato che il primo passo dell’ERAD è la selezione delle proteine mal ripiegate da parte dei chaperoni. Già nel 1999, è stato scoperto che i substrati ERAD del lievito differiscono notevolmente nel loro requisito per la Hsp70 ER-luminale, BiP. La degradazione di substrati solubili come pαF e una forma mutante della proteasi vacuolare carbossipeptidasi Y* (CPY*) erano dipendenti da BiP, mentre la degradazione delle proteine transmembrana Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p e Hmg2p avveniva in modo indipendente da BiP. Nel 2004, è stato dimostrato che i substrati con dominio citosolico come Ste6-166p sono stati degradati in modo BiP-indipendente, mentre le proteine con difetti luminali hanno richiesto BiP, suggerendo che a seconda della topologia della lesione misfolded (lume ER, membrana ER e citoplasma) i chaperon citosolici o luminali funzionano nel riconoscimento e nel targeting per la degradazione.

È possibile studiare il riconoscimento del substrato durante l’ERAD usando proteine modello misfolded. È chiaro che la de-mannosilazione è necessaria per la degradazione delle glicoproteine malripiegate, poiché l’inibizione di questa rifinitura del mannosio stabilizza le glicoproteine malripiegate nell’ER. La sovraespressione di ERMan1 accelera la degradazione delle proteine N-glicosilate. La glicoproteina contenente Man8-GlcNAc2 risultante dopo questa rifinitura diventa un substrato per EDEM1 (ER-degradation enhancing mannosidase-like protein 1, Htm1p nel lievito) – una lectina legata alla mannosidasi nell’ER. È stato inoltre proposto che le glicoproteine mal ripiegate interagiscano con ERManI e EDEM1 per la loro ERAD, e l’interazione lectina-carboidrato è risultata cruciale per il riconoscimento del substrato EDEM. Anche se ERMan1 è stato suggerito di essere un timer biologico che avvia l’ERAD delle proteine mal ripiegate, studi recenti hanno rivelato che le mannosidasi non sono le uniche responsabili della demannosilazione intensiva durante l’ERAD, soprattutto in condizioni non basali. In condizioni di stress ER (unfolded protein response active), l’elevazione trascrizionale di EDEM1 aumenta l’efficienza ERAD sopprimendo la downregulation proteolitica di ERMan1. È apparso che gli EDEM svolgono anche un ruolo importante nella demannosilazione dei substrati. EDEM1 impedisce anche la reglicosilazione e promuove la retrotraslocazione e la degradazione di alcuni substrati ERAD. D’altra parte, mentre il dominio di omologia della mannosidasi (MHD) di Htm1p è necessario per il legame del substrato, EDEM1 dei mammiferi lega le proteine misfolded indipendentemente dal dominio MHD, e quindi, il legame del substrato EDEM1 potrebbe non richiedere il trimming del mannosio o anche la glicosilazione. Così, oltre a N-linked moieties oligosaccaridi di glicoproteine, EDEM1 può riconoscere le lesioni di ripiegamento delle proteine misfolded. In sintesi, gli EDEM sono direttamente o indirettamente coinvolti nella demannosilazione delle glicoproteine e/o servono come recettori che legano e bersagliano le proteine con mannosio per l’ERAD (Figura 1).

La troncatura del mannosio terminale dal ramo C espone i residui di mannosio α terminale α1,6-bonded che funzionano come segnale di riconoscimento per le lectine ERAD come OS9 (Yos9 in lievito) e XTP3-B (Figura 2). Attraverso il loro dominio MRH (mannose-6-phosphate receptor homology), entrambe le proteine riconoscono principalmente α1,6-linked mannose j. Inoltre, OS-9 riconosce anche α1,6-linked mannose e e c.

Diversi rapporti suggeriscono che i fattori (EDEMs, OS9 e XTP3-B) richiesti per il riconoscimento e il targeting del substrato risiedono all’interno di complessi supramolecolari e/o interagiscono con importanti regolatori ERAD . Per esempio, EDEM1 interagisce con CNX, riceve substrati dal ciclo CNX e facilita la degradazione del substrato ERAD come NHK-α1-antitripsina mutante. EDEM1 si associa anche con i componenti del macchinario di retrotraslocazione ER. Si suggerisce che EDEM1 leghi le proteine mal ripiegate e utilizzi il suo dominio MHD per indirizzare le proteine aberranti alla glicoproteina SEL1L, residente nell’ER, del complesso di ubiquitina ligasi Hrd1-SEL1L. SEL1L impalcatura diversi fattori di riconoscimento dei substrati luminali e li collega a Hrd1. OS9 e XTP3-B si associano anche al complesso Hrd1-SEL1L, che include anche BiP e GRP94 . Inoltre, XTP3-B è proposto per collegare BiP con il complesso Hrd1. Secondo un’ipotesi, questi tre chaperon (EDEM1, OS9 e XTP3-B) funzionano come oligomeri, dove un monomero interagisce con il substrato e un altro con il complesso Hrd1-SEL1L. Inoltre, EDEM1 interagisce anche con Derlins, una proteina transmembrana, che è un candidato per il translocon; inoltre, Derlin2 ha dimostrato di migliorare l’interazione di EDEM1 con una AAA-ATPasi citosolica p97, che accoppia l’idrolisi dell’ATP alla retrotraslocazione delle proteine mal ripiegate.

È chiaro che la fase di riconoscimento del substrato di ERAD è un meccanismo complicato, in cui sono coinvolti diversi enzimi diversi e chaperon che hanno ruoli distinti ma concertati nella ERAD. Inoltre, a seconda dei substrati, il numero e le caratteristiche delle proteine coinvolte variano. Per esempio, sono stati suggeriti ruoli concertati di EDEM, ERdj5 e BiP nella degradazione delle proteine mal ripiegate. Dopo l’uscita dal ciclo CNX-CLR, EDEM1 rifinisce ulteriormente la struttura del glicano Man8-GlcNAc2 e ERdj5 riduce i legami disolfati. Contemporaneamente, ERdj5 attiva l’attività ATPasi di BiP. BiP legato all’ADP si lega alla proteina mal ripiegata e la trattiene in una forma di componente di retrotraslocazione fino al trasferimento nel complesso di retrotraslocazione.

ERAD è anche coinvolto nel controllo di qualità delle proteine non glicosilate, che è indipendente dalle proteine lectina-simili. La catena leggera dell’immunoglobulina (Ig-K-LC), un substrato ERAD non glicosilato, è degradata in modo BiP-dipendente. Okuda-Shimizu e Hendershot hanno caratterizzato un percorso ERAD per questo substrato BiP non glicosilato e diverse dinamiche di interazione proteica che giocano un ruolo in questo processo. Ig-K-LC ha due legami disolfuro intramolecolari, e la sua forma completamente ossidata non ha capacità di passare dall’ER al citoplasma. BiP interagisce solo con la forma parzialmente ossidata della Ig, impedendo la completa ossidazione della Ig-K-LC e facilitando così il suo rilascio dall’ER. Inoltre, una proteina transmembrana contenente il dominio UBL, la proteina omoCys-responsive ER-resident (HERP), è stata implicata come recettore per i substrati BiP non glicosilati. HERP interagisce con Derlin1, e l’Ig-K-LC parzialmente ossidato viene trasferito da BiP al complesso HERP-Derlin1-Hrd1 e successivamente diretto alla degradazione proteasomiale. Oltre a BiP, ERdj5 come disolfuro reduttasi è anche indicato per essere importante per ERAD di proteine non glicosilate. I substrati non glicosilati catturati da BiP sono trasferiti a ERdj5 per la scissione dei legami disolfuro. Poi, questi substrati sono trasferiti a SEL1L con l’aiuto di BiP per la retrotraslazione. Oltre a BiP, sia OS9 che XTP3-B sono stati implicati nell’ERAD di proteine non glicosilate.