Emocianina

Espressione ordinata di varie famiglie di geni V e acquisizione di specificità antigeniche durante l’ontogenesi

In studi pionieristici, Silverstein dimostrò che le risposte degli agnelli a certi antigeni, come virus, ferritina, azoproteine, ovoalbumina ed emocianina, potevano essere ottenute durante la vita fetale, mentre le risposte al tossoide difterico, all’antigene O e al BCG si verificavano solo dopo 40 giorni di vita postnatale. Gli studi sulle risposte anticorpali e sull’espressione degli idiotipi nei topi giovani hanno anche aiutato a dimostrare che c’è un’attivazione sequenziale o ordinata dei cloni durante la vita postnatale. Ci sono alcuni polisaccaridi come il β2-6 fruttosano, il lipopolisaccaride (LPS) di S. tranaroa con lo zucchero immunodominante α-metil-d-galattoside, o il β1-6 galattano, che possono suscitare una risposta immunitaria in topi di 1 giorno. L’immunizzazione con β2-6 fruttosano non è parallela ad un aumento dell’espressione dell’idiotipo cross-reattivo A48 e UPC10 (IdX). Al contrario, circa il 25% degli anticorpi LPS-specifici esprimono MOPC387 IdX di una proteina mieloma specifica per Salmonella tranaroa LPS. Allo stesso modo, topi di 1 giorno immunizzati con gomma ghatti sviluppano una significativa risposta antigalactan placca-forming cell (PFC), di cui il 30% ha espresso l’idiotipo X24. Gli studi sull’ontogenesi delle risposte anticorpali anti-fosfocolina (PC), fenilarsonato (Ars) e trinitrofenile (TNP) hanno dimostrato che la produzione di anticorpi contro questi antigeni, che condividono l’IdX delle proteine del mieloma con la stessa specificità, può essere indotta in topi di 1 settimana. Così la maggior parte dei precursori specifici del PC recanti IdX T15 possono essere rilevati 4-5 giorni dopo la nascita, mentre le cellule in grado di produrre anticorpi IdX+ Ars-specifici sono presenti prima del 7° giorno nei topi neonatali. L’immunizzazione di topi di 1 giorno con TNP-LPS e di topi di 1 settimana con TNP-Ficoll ha suscitato una significativa risposta anti-TNP. Tuttavia, il 460Id espresso sulla proteina del mieloma legante DNP MOPC460 è stato rilevato solo nei topi di 1 settimana immunizzati con TNP-LPS e nei topi di 3 settimane immunizzati con TNP-Ficoll. L’attivazione di 460Id+ cloni anti-TNP in topi di 7 giorni ha coinciso con l’età in cui avviene la diversificazione della risposta anti-TNP. Nel caso di α1-3 destrano, anche se i precursori che esprimono MOPC104Id possono essere rilevati durante la prima settimana di vita, i precursori J558IdX appaiono solo 15-22 giorni dopo la nascita e poi diventano rapidamente dominanti. Abbiamo inoltre osservato un sostanziale ritardo ontogenetico nel caso delle risposte anti-β2-1 fruttosano (inulina). Un aumento sostanziale della risposta anti-inulina con IdX è stato osservato solo in topi di 28 giorni. Questa risposta ritardata è associata a una mancanza di precursori nei giovani animali. Una risposta ontogenica ritardata è stata osservata anche nel caso di α1-6 destrano ed è anche legata all’assenza di precursori. Fernandez e Moller hanno effettivamente dimostrato che i precursori di anti-α1-6 destrano possono essere rilevati solo in topi di 1 mese di età.

La maggior parte dei dati discussi sopra riguarda antigeni T indipendenti e, quindi, le risposte ontogeniche ritardate non sono dovute all’immaturità delle cellule T. L’attivazione sequenziale di alcune risposte anticorpali non può essere attribuita alla mancanza di riarrangiamenti del gene V nei topi giovani. Sembra improbabile che la maturazione tardiva di alcune risposte possa essere spiegata dalla tolleranza dei precursori nei giovani animali. Nel caso delle risposte tardive anti-β2-1 fruttosano, il tollerogeno dovrebbe essere l’inulina piuttosto che il levan. La mancanza di reattività è limitata al β2-1 fruttosano e non al legame β2-1 fruttosano, ed entrambi gli epitopi sono portati dal levan batterico che è un antigene ambientale. Una spiegazione più plausibile è che l’attivazione sequenziale sia acquisita da meccanismi generativi indipendenti dall’antigene o dalle influenze delle cellule T. Alcuni meccanismi sconosciuti possono determinare il tempo di un particolare accoppiamento VH:Vκ che potrebbe essere critico per la specificità dei siti di combinazione che riconoscono particolari epitopi.

Infine, l’attivazione sequenziale dei cloni che esprimono un particolare insieme di geni V può essere guidata da forze interne come gli anticorpi anti-idiotipo. Questa idea è fortemente supportata dai dati di Vakil e Kearney che, analizzando la specificità di legame per alcuni importanti IdX di anticorpi prodotti da ibridomi originati dal fegato fetale o da neonati, hanno osservato che un numero elevato (7%) di essi mostrava attività anti-Id.

Ci sono numerosi geni della linea germinale VH e Vκ sia nel topo che nell’uomo. Sulla base dell’omologia della sequenza proteica, i geni della linea germinale VH e Vκ sono stati classificati in diversi sottogruppi e ora, sulla base dell’omologia del DNA, sono stati classificati in varie famiglie. I geni della linea germinale appartenenti a una famiglia sono raggruppati in cluster, raramente intervallati, e forniscono un ordine sul cromosoma 12 per la catena pesante o sul cromosoma 6 per la catena leggera Vκ.

L’analisi dell’espressione della famiglia di geni V in linee cellulari pre-B trasformate da Abelson ha mostrato un uso preferenziale delle famiglie 3′. Infatti, VH81X, il membro più D-proximal di questa famiglia di geni, è stato osservato in ibridomi di tipo cellulare pre-B così come quelli preparati da fegato fetale. Al contrario, risultati diversi sono stati ottenuti in studi in cui l’uso della famiglia di geni è stato indagato in linee cellulari pre-B non trasformate preparate da topi BALB/c nudi di 6-8 settimane. In questo studio, è stato dimostrato che tutte le sonde si sono ibridate con intensità rilevabile all’RNA delle cellule pre-B a riposo. Questi dati indicano che tutte le famiglie di geni VH erano trascrizionalmente attive nelle cellule pre-B a riposo di topi adulti. L’incubazione per 7 giorni con cellule dendritiche e linfociti T stimolati da mitogeni ha causato una maggiore espressione della famiglia VH7183, suggerendo che l’espressione di questa famiglia è regolata da fattori diversi dall’ontogenesi e, forse, è legata a stadi specifici della differenziazione della linea cellulare B. Il significato funzionale del riarrangiamento non casuale dei geni VH è di notevole importanza in termini di repertorio funzionale emergente delle cellule B del feto.

Yancopoulos e Alt hanno ipotizzato che la preferenza posizione-dipendente dell’utilizzo della famiglia VH nelle cellule pre-B e nel fegato neonatale è molto probabilmente legata a un meccanismo di inseguimento unidimensionale, mediato dalle ricombinasi, durante la giunzione VDJ piuttosto che a una giunzione dissociativa legata alle collisioni durante la diffusione tridimensionale. Ci sono dati che indicano che i geni VH di una famiglia possono essere sostituiti da geni VH di un’altra famiglia nei giovani linfociti. Sembra che la sostituzione dei geni V sia un evento piuttosto raro; tuttavia, può contribuire alla costituzione del repertorio delle cellule pre-B. Un insieme altamente ristretto di utilizzo del segmento del gene VH è stato osservato anche nelle cellule B fetali umane. L’analisi del repertorio VH umano a 130 giorni di gestazione ha mostrato un uso distorto di alcuni geni JH (JH3, JH4 e JH5) e, anche un gene VH designato 56P1 che mostra un’alta omologia con il VH81X murino, un membro della famiglia VH7183 riarrangiato preferenzialmente nelle cellule pre-B murine.

Similmente, alcune famiglie Vκ sono espresse preferenzialmente durante l’ontogenesi. Kaushik e colleghi hanno analizzato l’uso delle famiglie Vκ da parte delle cellule B neonatali murine utilizzando un test di colonia di cellule B indotto da LPS. I risultati mostrano che un gruppo di famiglie Vκ come Vκ1, Vκ9 e Vκ8, situate al centro del locus Vκ, sono altamente utilizzate dai topi neonatali C57BL/6. È interessante notare che l’espressione di Vκ21, la famiglia più prossimale di Jκ, non è stata osservata nelle colonie neonatali di cellule B. Questi dati suggeriscono che l’uso di Vκ nei topi neonatali non riflette un bias posizionale per l’espressione delle famiglie 3′, piuttosto un uso preferenziale della famiglia Vκ1 e Vκ9, situata al centro del locus Vκ. Le differenze implicano che i meccanismi per il riarrangiamento e l’espressione del gene Vκ differiscono da quelli che controllano il locus VH.