Elettroporazione e metodi di trasfezione concorrenti

Oltre all’introduzione diretta di geni, l’elettroporazione facilita il trasferimento diretto di plasmidi tra cellule o specie – per esempio, dai batteri al lievito.

Sperimentazione intensiva continua sull’uso dell’elettroporazione per fornire medicine e vaccini direttamente alle cellule di organismi viventi. Questo articolo si concentra sulle applicazioni non mediche.

L’elettroporazione è più comunemente usata per trasfettare le cellule in modo transitorio, anche se è possibile anche la trasfezione stabile. Nell’industria biofarmaceutica, la trasfezione transitoria permette la produzione di fino a pochi grammi di proteine per la caratterizzazione e gli studi preclinici. In questa applicazione l’elettroporazione che utilizza plasmidi ha dimostrato di essere affidabile e prevedibile. L’elettroporazione produce allo stesso modo cellule trasfettate in modo stabile, a condizione che il DNA sia introdotto in forma linearizzata trattandolo prima con un enzima di restrizione.

Una tecnica tra le tante

L’elettroporazione è saldamente stabilita nell’armamentario delle tecniche di trasfezione che includono vettori virali, metodi chimici o basati su reagenti, e consegna meccanica del gene. I vettori virali sono il metodo più comune per generare cellule trasfettate in modo stabile per la produzione di proteine terapeutiche. I vettori virali forniscono un’efficacia di trasfezione molto alta ma sono limitati in termini di lunghezza del DNA inserito. I vettori virali affrontano anche problemi legati alla biosicurezza e alla mutagenesi.

Altre tecniche meccaniche come la microprecipitazione, la microiniezione, i liposomi, il bombardamento di particelle, la sonorizzazione, la porazione indotta dal laser e la trasfezione con perline sono tutte impiegate sperimentalmente. Queste tecniche meccaniche hanno un filo comune. Distruggono le membrane cellulari e quindi permettono al DNA di entrare nella cellula. Alcuni approcci – la “pistola genica”, per esempio – prevedono la proiezione dei geni direttamente attraverso la membrana nel citoplasma. Da qui, i geni possono migrare al nucleo.

Inoltre, ci sono tecniche ibride che sfruttano le capacità dei metodi di trasfezione meccanica e chimica. Per esempio, numerosi articoli sono apparsi nell’ultimo decennio sulla magnetofezione, una metodologia di trasfezione che combina la trasfezione chimica con metodi meccanici. Per esempio, i lipidi cationici possono essere impiegati in combinazione con pistole geniche o elettroporatori. La maggior parte della letteratura sulla magnetoinfezione coinvolge la consegna di geni e molecole terapeutiche in organismi viventi.

L’elettroporazione ha diversi vantaggi: versatilità (funziona con qualsiasi tipo di cellula), efficienza, requisiti di DNA molto bassi, e la capacità di operare in organismi viventi. Gli svantaggi includono il potenziale danno cellulare e il trasporto aspecifico di molecole dentro e fuori la cellula.

Ma tra gli approcci di trasfezione chimica, meccanica e virale, l’elettroporazione da sola fornisce una ragionevole certezza di successo indipendentemente dalla cellula o dall’organismo bersaglio.

Per esempio, la trasformazione chimica e l’elettroporazione sono due metodi principali per introdurre DNA in Escherichia coli. Per quest’ultima, i batteri devono prima essere resi “competenti” rimuovendo i sali del tampone per assicurare che la corrente raggiunga le cellule, seguita dall’applicazione dell’impulso elettrico a 0°C per ridurre i danni ai microrganismi. La trasformazione chimica comporta la sospensione in CaCl2, che crea pori, seguita da uno shock termico che spazza il DNA nelle cellule.

Un altro approccio utilizza lipidi cationici per aprire le membrane cellulari. L’elettroporazione è meno ingombrante e più efficiente, funziona su tipi di cellule più vari e si presta più facilmente a metodi standard rispetto alla trasfezione chimica. Alcuni ricercatori preferiscono la trasformazione chimica, tuttavia, perché non richiede l’acquisto di uno strumento.

Aiutando l’innovazione

Anche se descritta per la prima volta nel 1965, l’elettroporazione continua ad aprire strade verso una scienza innovativa in termini di strumentazione, protocolli e sperimentazione. Almeno una dozzina di gruppi universitari hanno sviluppato dispositivi di elettroporazione basati su sistemi microelettromeccanici (MEMS). Un vantaggio dei dispositivi a microcanali è che possono essere progettati per applicare una tensione non superiore a quella sufficiente per ottenere una ragionevole incorporazione della macromolecola. Questo vantaggio è anche uno svantaggio. A differenza dei sistemi commerciali di elettroporazione, i chip non funzionano con tutte le cellule.

Un gruppo presso il Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Louisiana Tech University guidato da Shengnian Wang, Ph.D., ha scoperto che le nanoparticelle d’oro migliorano le prestazioni dei dispositivi commerciali di elettroporazione.1 Wang ritiene che le particelle, che sono altamente conduttive, riducono la conduttività del mezzo cellulare mentre agiscono come “microelettrodi virtuali” per aiutare ad aprire le membrane fosfolipidiche. Egli sostiene che le prestazioni sono migliorate (migliore efficienza di consegna del DNA) e maggiore vitalità delle cellule in virtù delle tensioni di porazione più basse.

Ricercatori della Charité Universitätsmedizin di Berlino2 hanno sviluppato una strategia di elettroporazione combinata a impulsi quadrati per la trasfezione riproducibile delle cellule. Britta Siegmund, M.D., e collaboratori sospendono le cellule in un tampone e le sottopongono a un impulso iniziale ad alto voltaggio seguito da un impulso a basso voltaggio di diverso valore elettrico e temporale. Il Dr. Siegmund sostiene che la vitalità è paragonabile all’elettroporazione standard e che le efficienze di trasfezione sono fino al 95%. Conclude che la tecnica può essere “facilmente adattata per cellule considerate difficili da trasfettare”.

Oltre al comune trasferimento di DNA, la transfezione è stata impiegata per introdurre RNA interferente in vari tipi di cellule. La tecnica permette lo studio controllato e su piccola scala del dosaggio e dell’efficienza della consegna. I problemi con il dosaggio e la consegna hanno afflitto le applicazioni pratiche dell’interferenza dell’RNA in terapia. Ma almeno uno studio ha messo in discussione se i geni dell’interferenza dell’RNA sono incorporati più efficacemente attraverso reagenti di trasfezione o elettroporazione in cellule primarie.3

Kirsty Jensen, Ph.D., e colleghi dell’Università di Edimburgo hanno confrontato l’efficacia di 11 kit di reagenti di trasfezione transitoria e l’elettroporazione per il silenziamento del gene immunomodulante della febbre mediterranea (MEFV) in macrofagi bovini derivati da monociti. Il gruppo ha testato le metodologie per l’assorbimento del piccolo RNA interferente, l’abbattimento del gene bersaglio, la tossicità cellulare e l’induzione della risposta dell’interferone di tipo I.

L’elettroporazione è stata circa altrettanto efficace nell’abbattimento del MEFV come i reagenti di trasfezione. A differenza dei reagenti, l’elettroporazione non ha indotto alcuna risposta di interferone, ma la vitalità delle cellule era inferiore. I problemi di vitalità ed efficienza di trasfezione per l’elettroporazione sono generalmente presi come una valutazione di valore nominale della tecnica.

Il dottor Jensen ha concluso che “l’uso di reagenti di trasfezione è più adatto di elettroporazione per il nostro lavoro che indaga il ruolo dei geni macrofagi ospite nella risposta all’infezione,” ma che “la scelta di trasfettare o elettroporare piccoli RNA interferenti nelle cellule dipende dai singoli esperimenti.”

In almeno alcuni casi in cui i risultati di elettroporazione sono subottimali, gli investigatori hanno trascurato di ottimizzare le condizioni diverse dalla forza dell’impulso elettrico. Come recentemente notato da Hu e collaboratori,4 l’efficacia di elettroporazione è influenzata da fattori non elettrici come il tipo di cella o tessuto e la formulazione del DNA.

Elettroporazione è diventato un metodo indispensabile per entrambi in vitro e in vivo biologia dello sviluppo. Una buona parte di questo lavoro avviene in singole cellule, contribuendo a un modello di grande interesse per la terapeutica, la diagnostica, la somministrazione di farmaci e la biologia cellulare. La nanoporazione diretta di singole cellule è difficile a causa dell’incertezza inerente alla vitalità post-porazione.

I ricercatori della Northwestern University hanno sviluppato una tecnica a singola cellula che fornisce alta vitalità ed efficienza.5 Il loro approccio utilizza un dispositivo cantilever microfabbricato, la nanofountain probe (NFP). Fornisce molecole alle cellule in modo più delicato rispetto alla microiniezione di massa o alla nanoporazione. I ricercatori hanno dimostrato l’elettroporazione mediata da NFP di singole cellule HeLa con un’efficienza di trasfezione migliore del 95%, una vitalità del 92% e un controllo qualitativo del dosaggio.

I NFP rappresentano un miglioramento rispetto alle vecchie tecnologie di trasfezione che utilizzano sonde per microscopio a forza atomica. Le tecniche basate sulla microscopia a forza atomica spesso causano la perdita di attaccamento o la rottura delle cellule. I PFN infliggono meno danni alle cellule.