Echovirus 4 associato alla malattia delle mani, dei piedi e della bocca

VIROLOGIA

Echovirus 4 associato alla malattia delle mani, dei piedi e della bocca

Echovirus 4 associado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Laboratorio Virus Enterici, Istituto Adolfo Lutz, San Paolo, SP, Brasile

Corrispondenza a

SUMMARIO

La malattia della mano, del piede e della bocca (HFMD) è un’infezione enterovirale contagiosa che si verifica principalmente nei bambini ed è caratterizzata da eruzioni vescicolari palmoplantari e stomatiti erosive. L’Echovirus 4 (EV-4) è stato comunemente associato alla meningite asettica. L’associazione della HFMD con l’EV-4 non è stata riportata in precedenza. Due campioni di un bambino di 14 mesi che presentava febbre lieve, piaghe in bocca, eruzione cutanea con vesciche sul palmo delle mani e sulle piante dei piedi sono stati inviati al Laboratorio Virus Enterici dell’Istituto Adolfo Lutz. I campioni clinici sono stati inoculati in tre diverse linee cellulari, e quelli che presentavano effetto citopatico (CPE), sono stati sottoposti a test di immunofluorescenza indiretta (IFA) e RT-PCR “one step”. L’elettroforesi del gel di agarosio dal prodotto RT-PCR ha mostrato un prodotto con 437 bp, che è caratteristico del gruppo Enterovirus. Echovirus 4 è stato identificato da IFA. Anche se la HFMD è un’infezione virale associata principalmente all’Enterovirus 71 (HEV-71) e al Coxsackievirus A16 (CV-A16), i nostri risultati dimostrano una diversità di sierotipi legati alla HFMD e sottolineano l’importanza della sorveglianza epidemiologica per questa malattia e le sue complicazioni.

Parole chiave: Malattia delle mani, dei piedi e della bocca; Enterovirus; Echovirus.

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) è un’infezione enterovirale contagiosa che si verifica principalmente nei bambini, essendo caratterizzata da eruzioni palmoplantares vesiculares ed estomatite. L’Echovirus 4 (EV-4) è comunemente associato alla meningite asséptica. L’associazione di DMPB con EV-4 non è stata descritta in precedenza. Due campioni di un bambino di 14 mesi che presentava febbre, secrezioni della gola ed eruzioni cutanee sui palmi delle mani e dei piedi sono stati inviati al Laboratorio di Virus Enterici dell’Istituto Adolfo Lutz. I campioni sono stati inoculati in tre diverse linee cellulari; quelli che hanno presentato un effetto citopatico (CPE), sono stati sottoposti al test di immunofluorescenza indiretta (IFI) e alla RT-PCR “one step”. L’elettroforesi su gel di agarosio eseguita con il prodotto della PCR ha mostrato un prodotto di 437pb, caratteristico del gruppo Enterovirus. Il sierotipo EV-4 è stato identificato da IFI. Sebbene la DMPB sia un’infezione virale associata principalmente all’Enterovirus 71 (HEV-71) e al Coxsackievirus A16 (CV-A16), i nostri risultati sottolineano la necessità di studi epidemiologici e di laboratorio che mirino all’EV-4 come agente causale della DMPB.

INTRODUZIONE

La malattia della mano, del piede e della bocca (HFMD) è una malattia comune dei neonati e dei bambini sotto i 10 anni ed è caratterizzata da febbre, piaghe in bocca ed eruzione con vesciche. La HFMD inizia con una leggera febbre, scarso appetito, malessere e spesso mal di gola. Uno o due giorni dopo, si osserva la febbre e lo sviluppo di piaghe in bocca. Piccole macchie rosse con vesciche che diventano ulcere appaiono comunemente. Di solito si trovano sulla lingua, sulle gengive e all’interno delle guance. L’eruzione cutanea si sviluppa in 1-2 giorni con macchie rosse piatte o in rilievo, e alcune con vesciche. L’eruzione non prude e di solito si trova sui palmi delle mani e sulle piante dei piedi. Appare anche sulle natiche. Anche se, alcune persone con HFMD possono avere solo eruzione cutanea o ulcere della bocca4.

La trasmissione avviene da persona a persona per contatto diretto con gli scarichi di naso e gola o per via orale fecale. La HFMD non si trasmette a o da animali domestici o altri animali. Casi individuali di HFMD si verificano in tutto il mondo, più frequentemente in estate e all’inizio dell’autunno4. Si verifica anche la diffusione verticale dalla madre al feto ma, i casi si risolvono senza complicazioni a lungo termine, l’infezione del primo trimestre può portare ad aborto spontaneo o ritardo della crescita intrauterina. Sono state segnalate altre complicazioni tra cui miocardite, meningoencefalite, edema polmonare e persino la morte16.

Il primo rapporto HFMD è stato fatto da ROBINSON & RHODES nel 195812. Hanno riportato un esantema con febbre associata e lesioni orali, notato in oltre 60 persone nel giugno e luglio 1957 a Toronto, Canada. Coxsackievirus A16 (CV-A16) è stato isolato da due terzi dei 27 campioni di feci studiati. La successiva epidemia riportata di Coxsackievirus si verificò a Birmingham, in Inghilterra, nell’estate del 1960 e fu descritta da ALSOP et al.2 che notarono lesioni vescicolari sulle mani e sui piedi con lesioni orofaringee e che chiamarono l’eruzione hand, foot and mouth disease16.

LaHFMD è causata da Enterovirus, membri della famiglia dei Picornavirus (RNA a singolo filamento, non avvolto) ed è più comunemente associata al CV-A16 o all’Enterovirus 71 (HEV-71). Sono stati riportati anche casi sporadici associati a CV-A4 a CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1 a CV-B3 e CV-B5. Le infezioni sono solitamente sporadiche ma si verificano regolarmente epidemie. L’infezione virale iniziale riguarda la mucosa buccale e ileale ed è seguita dalla diffusione ai linfonodi regionali entro 24 ore. La viremia segue rapidamente e il virus si diffonde alla mucosa orale e alla pelle. Circa il 7° giorno dopo l’infezione, i livelli di anticorpi nel siero possono iniziare ad aumentare 6,8.

PATIENTI E METODI

Campioni: Durante il luglio 2003 un focolaio di HFMD si è verificato in un centro diurno nella città di San Paolo, e due campioni di feci di un bambino maschio di 14 mesi caso sospetto sono stati inviati a Enteric Virus Laboratory di Adolfo Lutz Institute. Ha presentato febbre, piaghe in bocca, malessere, scarso appetito ed eruzione cutanea sui palmi e sulle piante dei piedi. Altri otto bambini dello stesso centro, in una gamma da 10 mesi a tre anni, hanno presentato sintomi simili. La HFMD è stata diagnosticata da altri centri medici (comunicazione personale). Era impossibile raccogliere campioni di siero appaiati per procedere ai test sierologici per la titolazione degli anticorpi.

Isolamento e identificazione virale: I campioni raccolti entro sei giorni dal giro, sono stati chiarificati sotto centrifugazione a 10.000 x g/60 minuti, a 4 ºC; sono stati aggiunti antibiotici (streptomicina e penicillina) e il surnatante è stato conservato a -70 ºC fino all’inoculazione (0,1 e 0,2 mL/tube) su tre diverse linee cellulari: RD (rabdomiosarcoma umano), HEp 2 (carcinoma epidermico della laringe umana) e Vero (rene verde di scimmia) contenenti un mezzo essenziale minimo (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvate, e 199 medium, rispettivamente). Dopo, le provette sono state tenute a 35-37 ºC. Le culture sono state osservate al microscopio invertito ogni giorno, al fine di visualizzare l’effetto citopatico (CPE). Passaggi successivi del materiale inoculato sono stati fatti fino alla comparsa o meno di CPE caratteristici dell’infezione da HEV7.

Saggio di immunofluorescenza indiretta – IFA: quando la coltura cellulare ha presentato almeno il 75% di CPE, è stata raschiata dalla provetta e la sospensione cellulare è stata macchiata su un vetrino, che sono stati asciugati all’aria e fissati con acetone. Poi, è stata sottoposta al test di immunofluorescenza indiretta (IFA), utilizzando anticorpi monoclonali specifici, disponibili in commercio (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) per genere, gruppo e sierotipi HEV. I pozzetti del vetrino sono stati esaminati con un microscopio a epifluorescenza3.

RT-PCR: L’RNA virale è stato estratto dal virus isolato con Trizol® LS (Invitrogen, cat. 1296-010) e cloroformio, secondo le istruzioni del produttore. Dopo la centrifugazione a 12.000 xg, la fase acquosa è stata separata e la precipitazione è stata fatta con alcol isopropilico. Il pellet di RNA è stato lavato con etanolo al 75%. Alla fine della procedura, l’RNA è stato asciugato brevemente e risospeso con acqua Milli-Q; è stata aggiunta RNAsin e l’RNA è stato conservato a -70 ºC. Il cDNA è stato sintetizzato usando l’RNA estratto e la miscela: 50 mM MgCl2; 10x PCR buffer; 1.25 nM dNTP; 20 µM/µL primer AS1/S1; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2.5 U/µL TaqQ DNA Polymerase; 40 U/µL RNAsin e acqua Milli-Q. Le reazioni di amplificazione sono state eseguite nel termociclatore Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer con la seguente programmazione: (42 ºC/1h) + (95 ºC/5 min) + 25 cicli (94 ºC/1 min + 50 ºC/2 min + 72 ºC/1min) + (72 ºC/7min). I prodotti di PCR sono stati separati da un gel di agarosio all’1,5%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati sotto la luce UV. I primer diretti alla regione 5’non tradotta hanno amplificato un prodotto di 437 bp13.

RISULTATI

CPE suggestivi di HEV: arrotondamento, restringimento, pyknosis nucleare, refrattarietà e degenerazione cellulare erano sensibili alle cellule RD e Vero. Il tempo di segnalazione delle colture positive era di circa 4-7 giorni.

Al microscopio a epifluorescenza, a 400x, si poteva osservare una fluorescenza verde mela brillante nel nucleo e/o nel citoplasma delle cellule, indicando una reazione positiva al sierotipo 4 dell’echovirus. L’IFA era negativo per gli altri anticorpi monoclonali.

RT-PCR è stata applicata per confermare il genere HEV. L’elettroforesi del gel di agarosio ha mostrato un prodotto con 437 bp, identificando HEV (Fig. 1).

DISCUSSIONE

L’agente eziologico identificato in questo studio è HEV diverso dagli altri precedentemente correlati alla HFMD. Questa sindrome è stata comunemente associata a CV-A16 e HEV-71 mentre nessun dato epidemiologico su EV-4 associato a HFMD, è stato trovato in letteratura.

Mentre l’epidemia di HFMD verificatasi in Malesia (1997) era associata a EV-1, CV-A9 e HEV-711. La HFMD causata da HEV-71 è stata associata a casi mortali di encefalite durante i focolai in Malesia (1997) e Taiwan (1998)17. EV-7 è stato trovato nell’ultima parte del 2000, oltre a CV-A16 e EV-7, come agente eziologico della HFMD5. In Brasile, MOREIRA et al., (1995) riferirono di una malattia esantematica epidemica associata al coxsackievirus B3 (CV-B3)10. Nessun rapporto circa l’associazione con EV-4 e HFMD è legato in Brasile, forse a causa della mancanza di sospetti clinici.

L’EV-4 è generalmente correlato con meningite asettica, encefalite, paralisi, sindrome di Güillan-Barré, esantema e malattie respiratorie ed è stato trovato in tutto il mondo, principalmente come causa di focolai di meningite asettica: a Cuba, dal 1972 al 1999; a Città del Capo, in Sudafrica, dal 1981 al 1989; nell’aprile 1997 in regioni di Israele e dell’Autorità Palestinese; in Spagna dal 1988 al 2003; nell’autunno 1982 in Polonia e a Vellore e zone limitrofe in India nel 20028,9,11,14,15,18.

In genere, le infezioni da enterovirus sono asintomatiche o provocano una malattia lieve. Quindi, si raccomanda di raccogliere campioni di siero per procedere alla titolazione degli anticorpi con la tecnica di microneutralizzazione, che sarebbe un ulteriore parametro per confermare che il virus isolato è il responsabile della malattia. Associato all’isolamento delle feci, l’aumento di quattro volte della titolazione del siero (sieroconversione) conferma l’infezione acuta. Purtroppo, non è stato possibile ottenere campioni di siero in questo studio.

Nonostante, tutti gli altri otto bambini sono stati diagnosticati come HFMD da centri medici, sulla base dei segni clinici.

Anche se questo risultato potrebbe non essere sufficiente per affermare che EV-4 era una causa di malattia, sembrava ragionevole concludere che i segnali e le manifestazioni cliniche evidenti confermano l’ipotesi che il virus non è un virus di passaggio.

È importante accentuare che CV-A16 e HEV-71, conosciuti come la causa principale di HFMD, di solito producono CPE nelle culture cellulari RD, HEp2 e Vero; ma in questo studio non sono stati identificati.

Il nostro lavoro mostra l’EV-4 come agente causale della HFMD e suggerisce la possibilità che altri sierotipi HEV, potrebbero essere eventualmente collegati ai casi di HFMD. Questo case report sottolinea la necessità di intensificare gli studi epidemiologici e di laboratorio su questo sierotipo e la sorveglianza di altri sierotipi di HEV coinvolti nella HFMD deve essere aumentata in Brasile.

Riconoscimenti

Siamo particolarmente grati al Dr. Luís Florêncio Salles Gomes per i suoi suggerimenti e critiche su questo articolo.

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