Differenziazione genomica e struttura di popolazione intercontinentale di zanzare vettori Culex pipiens pipiens e Culex pipiens molestus

Origine monofiletica indipendente di Culex pipiens pipiens e Culex pipiens molestus

Sono state proposte due ipotesi alternative per spiegare le differenze nelle strategie ecologiche e fisiologiche di Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus19. Un’ipotesi spiega tale differenziazione come un rapido cambiamento nei tratti fisiologici e comportamentali come adattamento a un ambiente sotterraneo associato alle attività umane22. In questo scenario, le popolazioni locali di Cx. p. molestus devono essere strettamente legate alle popolazioni locali di Cx. p. pipiens30. Questo scenario considera Cx. p. molestus come una variante eco-fisiologica di Cx. p. pipiens. Un’ipotesi alternativa suggerisce che la differenza tra Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus è il risultato della distinzione nella loro storia evolutiva. Le strategie ecologiche e fisiologiche di Cx. p. molestus potrebbero essere sorte inizialmente sotto il clima caldo19. Più tardi, tale strategia è apparsa rilevante a causa delle attività umane che hanno creato un ambiente sotterraneo e, quindi, hanno diffuso Cx. p. molestus in tutto il mondo. Questo scenario considera Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens come entità evolutive separate.

Nel nostro studio, abbiamo testato queste ipotesi utilizzando l’analisi del genoma intero di 40 campioni di Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens raccolti da quattro località in Eurasia e Nord America. I nostri risultati hanno respinto l’ipotesi di riemergenza di Cx. p. molestus dalle popolazioni locali di Cx. p. pipiens e hanno fortemente sostenuto l’idea di un’origine monofiletica indipendente di entrambi Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus da diversi continenti. Le analisi NJ e ML raggruppano separatamente Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus dalla Repubblica di Bielorussia, dalla Repubblica del Kirghizistan e da Chicago, IL, USA (Fig. 2, Figg. supplementari 1-3). La presenza di un ulteriore cluster ibrido formato da esemplari autogeni e anautogeni raccolti sul campo da Washington, D.C., USA riflette più probabilmente l’esistenza di una zona ibrida Cx. pipiens – Cx. quinquefasciatus in quest’area16. Tuttavia, in base alle distanze genetiche, questo cluster è molto più vicino al Cx. p. pipiens eurasiatico piuttosto che al Cx. p. molestus dell’Eurasia e degli Stati Uniti (Chicago, IL). Inoltre, le analisi PCA (Fig. 3) e ADMIXTURE (Fig. 4) hanno identificato due cluster genetici distinti che corrispondono a Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus. In entrambi i casi, tutti gli esemplari provenienti da Washington, D.C. si sono raggruppati insieme a Cx. p. pipiens di altre località. I valori Fst a livello genomico erano altamente significativi per tutti i confronti (Fig. 5). Non abbiamo identificato alcuna regione specifica di alta divergenza nel genoma (Fig. 6). Nel complesso, i valori Fst erano molto più alti tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens che tra i campioni autogeni e anautogeni di Cx. p. pipiens da Washington, D.C. Il gruppo più divergente, basato su tutte le analisi condotte, era il ceppo di Cx. p. molestus da Chicago, IL, che può essere spiegato dalla diversità genetica molto bassa di questo ceppo causato dalla sua lunga colonizzazione e possibile collo di bottiglia, che ha accelerato la deriva genetica (Fig. 7).

Osservazioni simili circa l’origine monofiletica indipendente di Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens sono stati ottenuti utilizzando l’analisi dei microsatelliti in ~ 600 campioni di zanzare Cx. pipiens derivati da diverse località del mondo19. La procedura di albero di distanza non radicata clustered popolazioni fuori terra di Cx. p. pipiens e popolazioni sotterranee di Cx. p. molestus dal nord e sud Europa separatamente. Similmente al nostro studio, le popolazioni fuori terra di Cx. p. pipiens degli Stati Uniti hanno formato un ulteriore cluster che suggerisce una più intensa ibridazione tra i membri del complesso Cx. pipiens in Nord America. L’analisi di commistione ha indicato la presenza di tre cluster principali che corrispondono a Cx. p. molestus, Cx. p. pipiens e Cx. quinquefasciatus. Quest’ultimo cluster è stato trovato in questo studio solo nei campioni USA. Un altro lavoro basato su analisi di polimorfismo a lunghezza di frammento amplificato (AFLP) ha confrontato campioni dall’Europa meridionale e settentrionale e ceppi da Chicago, IL, USA24. Le popolazioni nordamericane ed europee utilizzate in questo studio hanno mostrato un modello ADMIXTURE simile nella scansione del genoma AFLP. L’analisi dei geni COI ha anche indicato un’origine monofiletica di Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus in Europa, Asia e Africa26.

Quindi, l’origine monofiletica indipendente e l’alto livello di divergenza genetica tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens suggeriscono che questi due membri del complesso Cx. pipiens rappresentano entità filogenetiche distinte con storie evolutive indipendenti prima della traslocazione mediata dall’uomo.

Concetti di speciazione ed evoluzione del complesso Culex pipiens

I modelli teorici di speciazione negli animali potrebbero essere suddivisi in due gruppi principali: speciazione allopatrica o geografica e speciazione simpatrica o ecologica. Il primo concetto di speciazione, che è stato intensamente promosso da E. Mayr3, suggerisce che i taxa incipienti diventano prima isolati geograficamente. Questa situazione riduce il flusso genico tra le popolazioni e può portare all’accumulo di mutazioni che causano incompatibilità genetica tra gli ibridi. Un concetto alternativo di speciazione enfatizza le barriere ecologiche tra i taxa emergenti come principali motori dell’evoluzione31. Questo scenario considera lo sviluppo dell’isolamento riproduttivo tra le popolazioni come risultato dell’adattamento ad ambienti diversi senza isolamento geografico, che di solito avviene di fronte al flusso genico. In questa situazione, gli ibridi tra taxa incipienti diventano meno adatti all’ambiente che promuove la selezione naturale di qualsiasi tratto che riduce l’accoppiamento tra loro. Pensiamo che la diversificazione complessiva delle sottospecie Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus rappresenti un esempio eclatante di speciazione attraverso meccanismi di isolamento per ecologia. Nel nostro studio, l’analisi Fst ha determinato livelli significativi di divergenza genomica tra Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus (Figg. 5 e 6) attraverso l’intero genoma senza chiare isole di speciazione. Sorprendentemente, i livelli di differenziazione erano più bassi intorno ai centromeri, probabilmente a causa del basso numero di SNV affidabili in queste regioni altamente ripetitive. La differenziazione era estremamente alta tra i ceppi di Chicago, IL, USA di Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus, ma era inferiore tra le sottospecie nelle collezioni di zanzare eurasiatiche. Nel complesso, queste osservazioni suggeriscono una significativa restrizione del flusso genico tra le sottospecie.

Sono stati descritti diversi meccanismi di isolamento riproduttivo tra Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus17. Due di loro sono prezygotic agire, prima della fecondazione, e ridurre le opportunità di accoppiamento della zanzara. Il primo meccanismo è legato alla specializzazione dell’habitat delle larve: Cx. p. molestus occupa scantinati o altri ambienti sotterranei, ma Cx. p. pipiens preferisce corpi idrici aperti in superficie per i siti di riproduzione. Questo riduce le possibilità per le due sottospecie di incontrarsi e accoppiarsi negli stadi adulti. Il secondo meccanismo di isolamento si basa sulle differenze nel comportamento di accoppiamento tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens. I maschi di Cx. p. molestus di solito formano sciami omogenei vicino al suolo e richiedono uno spazio limitato per l’accoppiamento17. Al contrario, i maschi di Cx. p. pipiens sciamano vicino al fogliame a circa 2-3 m dal suolo. Studi sperimentali sul comportamento di accoppiamento in piccole gabbie hanno indicato che in incroci di femmine e maschi di Cx. p. molestus il successo della copulazione era del 90% ma in Cx. p. pipiens era solo del 3,3%32. Negli incroci interspecie tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens, il successo di copulazione era anche basso e variava tra il 6,6% al 10% a seconda dei sessi delle sottospecie. Questo studio ha dimostrato che le femmine di entrambe le sottospecie evitano attivamente la copulazione con i maschi di una sottospecie alternativa. Inoltre, le femmine di Cx. p. pipiens non riuscivano a ricevere lo sperma di Cx. p. molestus e, di conseguenza, non producevano uova.

Altri due meccanismi di isolamento riproduttivo descritti per Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus sono postzigotici, agiscono dopo l’accoppiamento e comportano una diminuzione della fitness degli ibridi. Uno dei meccanismi è legato all’ereditarietà della diapausa negli ibridi di Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens come tratto recessivo8. Gli ibridi F1 e una parte significativa degli ibridi F2 non sono in grado di sviluppare la diapausa e non possono sopravvivere in condizioni invernali. Questo meccanismo, forse, potrebbe spiegare i più alti livelli di introgressione in Cx. p. pipiens in località meridionali19,23,24. Infine, i membri del complesso Cx. pipiens sono esposti all’incompatibilità citoplasmatica degli ibridi infettati con ceppi diversi del parassita rickettsial Wolbachia pipientis. Nonostante l’introgressione citoplasmatica di questo parassita attraverso l’ibridazione tra i membri del complesso Cx. pipiens33, l’incompatibilità citoplasmatica potrebbe limitare significativamente i tassi di sopravvivenza degli ibridi. Per esempio, l’infezione da W. pipientis ha ridotto significativamente l’ibridazione tra Cx. pipiens e Cx. quinquefasciatus in Sud Africa34. Un altro studio ha dimostrato che nelle popolazioni eurasiatiche Cx. p. molestus era infettato solo da un ceppo di W. pipientis ma Cx. p. pipiens da due ceppi diversi35. Inoltre, gli esemplari di Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens, che abbiamo utilizzato nel nostro studio, sono stati infettati dagli stessi ceppi di W. pipientis nel sud della Repubblica del Kirghizistan ma da ceppi diversi nel nord della Repubblica di Bielorussia. Così, può spiegare le differenze di introgressione da Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens che era più pronunciato nella Repubblica di Bielorussia che nella Repubblica del Kirghizistan. Infatti, un interessante esempio di speciazione infettiva è stato descritto nel complesso sudamericano Drosophila paulistorum. In questo complesso, sei semispecie con distribuzione geografica sovrapposta si sono isolate riproduttivamente come risultato dell’isolamento prematrimoniale e postmatrimoniale innescato dall’infezione da Wolbachiae36.

Recenti studi genomici condotti su diversi organismi tra cui Drosophila simulans37, moscerini della frutta Rhagoletis38,39, e farfalle Heliconius40,41 forniscono ulteriori prove che la speciazione ecologica avviene in natura. I modelli genomici della speciazione possono essere molto diversi2 e vanno da piccole isole genomiche di speciazione40 a livelli significativi di divergenza nell’intero genoma. Una diffusa divergenza genomica è stata identificata tra le specie incipienti Anopheles gambiae e An. coluzzii nel complesso An. gambiae42. Queste specie sono state originariamente identificate dalle differenze nella struttura del loro DNA ribosomiale come forme S e M43, ma successivamente il loro status tassonomico è stato elevato al livello di specie44. Si ritiene che An. gambiae e An. coluzzii sviluppino barriere riproduttive in simpatria come risultato delle differenze nelle loro preferenze ecologiche45. Lo stadio larvale di An. gambiae è associato a piccole pozze d’acqua. Al contrario, An. coluzzi sfrutta i serbatoi d’acqua persistenti associati alla coltivazione del riso. Sebbene le barriere di prematrimonio tra le specie siano incomplete46, esse hanno sviluppato differenze nel loro comportamento di sciamatura47,48 e tipi di canto divergenti49.

Quindi, un alto livello di divergenza a livello genomico, una notevole differenza di adattamento ad ambienti ecologici distinti e l’evidenza di barriere prezigotiche e postzigotiche per l’accoppiamento suggeriscono che Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus rappresentano unità ecologiche distinte che subiscono un’incipiente speciazione ecologica.

Ibridizzazione nel complesso Culex pipiens

L’osservazione più intrigante dei membri del complesso Cx. pipiens è che, nonostante le differenze in ecologia, fisiologia, comportamento e distribuzione geografica, essi possono ancora ibridarsi e produrre progenie vitale in natura, indicando che l’isolamento riproduttivo tra loro non è completo. Il nostro studio ha anche dimostrato significativi eventi di ibridazione tra le sottospecie Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens. Il confronto del genoma intero ha indicato che la maggior parte dei campioni di Cx. p. pipiens rappresentano individui con un certo livello di introgressione da Cx. p. molestus (Fig. 4). Abbiamo osservato un’elevata discrepanza tra le filogenesi nucleari e mitocondriali (Figg. 2, 8), il che indica che, storicamente, la trasmissione dei genomi mitocondriali può avvenire tra le sottospecie. Allo stesso tempo, non abbiamo osservato aplogruppi condivisi tra le popolazioni locali delle sottospecie. Nei continenti, tutte le filogenie mitocondriali erano fortemente monofiletiche, il che indica la dispersione e l’ibridazione mediata dai maschi. La commistione con Cx. p. molestus era maggiore nelle popolazioni meridionali di Cx. p. pipiens nella Repubblica del Kirghizistan e a Washington, D.C., USA, ma minore nelle popolazioni settentrionali nella Repubblica di Bielorussia e a Chicago, IL, USA. Questo potrebbe essere legato all’incapacità degli ibridi di sviluppare la diapausa nei climi freddi. Per confronto, l’analisi dei microsatelliti ha rivelato un modesto livello di ibridazione tra Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus di ~8% nelle città del nord degli USA (Chicago, IL e New York, NY)30,50. Nell’Europa meridionale, dove Cx. p. pipiens e Cx. p. molestus potevano essere trovati entrambi fuori terra, i livelli di ibridazione tra loro erano simili ed è stato stimato all’8-10%51. Livelli molto più alti di ibridazione sono stati trovati nelle popolazioni meridionali negli Stati Uniti orientali, dove ~40% di tutti i campioni sono stati identificati come ibridi tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens19. Quindi, i tassi complessivi di ibridazione tra i membri di Cx. pipiens erano più alti in Nord America che nel Vecchio Mondo. Per confronto, l’ibridazione tra specie criptiche nel complesso An. gambiae (An. gambiae e An. coluzzi) variava significativamente tra l’1% in Mali46 e >20% in Guinea Bissau52, che è paragonabile ai livelli di ibridazione globale tra Cx. p. molestus e Cx. p. pipiens.

Intrigante, nel nostro studio, non abbiamo determinato un Cx. p. pipiens firma commistione in qualsiasi Cx. p. molestus campioni dalla Repubblica di Bielorussia, la Repubblica del Kirghizistan, e Chicago, IL, USA (Fig. 4). Questi risultati dimostrano un flusso genico molto limitato o nullo da Cx. p. pipiens a Cx. p. molestus. Risultati simili di introgressione asimmetrica da Cx. p. molestus a Cx. p. pipiens è stato dimostrato da studi precedenti20,51. Il meccanismo di introgressione asimmetrica è attualmente sconosciuto. Un’ipotesi suggerisce che i maschi di Cx. p. molestus, che possono accoppiarsi in spazi ristretti, possono ibridarsi sia con le femmine di Cx. p. molestus che di Cx. p. pipiens. Al contrario, Cx. p. pipiens maschi, che richiedono spazio per lo sciamare, hanno una maggiore disposizione ad accoppiarsi con le femmine di Cx. p. pipiens51. Tuttavia, sono necessari più studi genetici di popolazione e sperimentali per spiegare questo fenomeno.

Infine, il nostro studio ha dimostrato che Cx. p. pipiens può sviluppare autogenia come risultato dell’introgressione adattativa del materiale genetico da Cx. p. molestus. Nei campioni raccolti sul campo da ambienti fuori terra e sotterranei a Washington, D.C., USA, abbiamo selezionato le zanzare per l’autogenia. Le zanzare sotterranee erano autogene ma le zanzare in superficie erano anautogene. Tuttavia, le zanzare di entrambe le colonie autogene e anautogene hanno formato un unico cluster quando è stata applicata l’analisi dei vicini (Fig. 2). Inoltre, gli approcci PCA (Fig. 3) e ADMIXTURE (Fig. 4) raggruppano questi campioni insieme a Cx. p. pipiens da altre località. Popolazioni con caratteristiche miste sono state trovate in Europa51 e negli USA53. In Portogallo, un modello insolito di comportamento di alimentazione sanguigna sugli uccelli è stato trovato anche in Cx. p. molestus54.

Quindi, la presenza di ibridazione in corso tra i membri del complesso Cx. pipiens suggerisce che il processo di speciazione tra loro non è completo e le barriere postzigotiche di isolamento riproduttivo non sono completamente formate. Nel complesso, crediamo che i membri del complesso Cx. pipiens rappresentino un modello notevole per studiare diversi aspetti della speciazione geografica ed ecologica di fronte al flusso genico in corso tra di loro e agli adattamenti locali ai diversi ambienti.