Derivatizzazione chimica in bioanalisi

Applicazioni

La derivatizzazione chimica si è dimostrata a lungo una tecnica analitica in bioanalisi per superare i problemi associati alla bassa efficienza di ionizzazione, instabilità del composto, scarsa selettività o prestazioni cromatografiche inaccettabili (scarsa ritenzione, cattiva forma dei picchi e problemi di carryover) e anche scarsa volatilità per la separazione GC. Questa tecnica è uno strumento potente in molte aree della chimica, comprese le discipline mediche, forensi, alimentari, di controllo del doping e ambientali. L’obiettivo della derivatizzazione chimica è quello di modificare la struttura dell’analita (un nucleofilo o un elettrofilo) utilizzando un reagente chimico (un elettrofilo o un nucleofilo a seconda della natura dell’analita) e, come risultato, si forma un nuovo composto (il derivato della reazione) con migliori proprietà chimiche e fisiche per l’analisi. Le condizioni di reazione (quantità del reagente, tempo e temperatura di reazione, ecc.) sono ottimizzate a favore della formazione del derivato desiderato con la massima resa di reazione possibile. Ulteriori procedure di pulizia del campione possono essere sviluppate per eliminare i sottoprodotti indesiderati e i reagenti in eccesso, minimizzando così le inferenze dell’analita all’analisi.

Utilizzando la derivatizzazione chimica, l’analisi dell’impossibile diventa possibile. Molti esempi di questo sono stati presentati in letteratura; con impatto su GC, LC-MS/MS e rilevamento NMR. La più notevole è stata la separazione cromatografica degli enantiomeri attraverso la derivatizzazione chirale usando reagenti risolutivi specifici senza l’uso di colonne chirali specializzate e condizioni di separazione.

Considerazioni

La selezione del reagente chimico appropriato è essenziale per una derivatizzazione di successo e dipende dall’applicazione specifica. In generale, se l’analita target è un nucleofilo (composto con un eccesso di elettroni), un elettrofilo (composti con carenza complessiva di elettroni) viene selezionato come reagente, e viceversa. I reagenti devono essere selettivi (bersaglio un sito specifico della molecola), evitando così la derivatizzazione in più siti nella molecola bersaglio, nei metaboliti o nei componenti endogeni. Per esempio, per una molecola che contiene sia gruppi funzionali idrossilici che amminici, l’uso di cloruri acidi o anidridi come reagenti di derivatizzazione dovrebbe essere evitato perché questi derivatizzeranno entrambi i gruppi funzionali. Al contrario, l’uso del cloruro di dansile come reagente di derivatizzazione è appropriato per i gruppi funzionali amminici e fenolici poiché non reagisce con gli alcoli alifatici. Altri requisiti da considerare nella selezione del reagente sono la disponibilità (in commercio), la purezza e il costo. In genere, il costo dei reagenti è minimo, e quindi non rappresenta una barriera per l’uso.

Utilizzando condizioni ottimizzate, le procedure di derivatizzazione chimica sono in genere abbastanza robuste da essere applicate per la bioanalisi farmaceutica, e sono in grado di soddisfare le aspettative normative. Questo è solitamente dimostrato durante un rigoroso processo di convalida in cui diversi parametri, inclusi, ma non limitati a, accuratezza, precisione, selettività, effetto matrice, ecc. La selezione dello standard interno è essenziale per correggere qualsiasi possibile perdita di analita durante le varie fasi della manipolazione del campione e della bioanalisi, garantendo così la robustezza del test. Quando possibile, dovrebbe essere usato uno standard interno stabile al deuterio o al 13C, altrimenti si potrebbe sostituire un analogo con reattività, recupero e proprietà cromatografiche simili. Inoltre, è imperativo considerare e valutare, dove possibile, percorsi metabolici dell’analita di interesse; conversione di metaboliti indietro alla molecola madre devono essere evitati durante la procedura di derivatizzazione, come questi processi spesso coinvolgono condizioni difficili (pH, calore, lunghi tempi di incubazione, ecc). Sfortunatamente, questo può essere complicato dalla mancanza di standard di riferimento per i metaboliti e dalla mancanza di informazioni metaboliche all’inizio del ciclo di vita dello sviluppo della droga a causa di strategie di sviluppo differenziale o accelerato.

Derivatizzazione chimica come forma d’arte

L’uso della derivatizzazione chimica è diminuito negli ultimi anni con l’evoluzione delle nuove tecnologie di separazione che sono diventate più comuni. L’evoluzione della cromatografia con fluido supercritico (SFC), per esempio, ha aperto una nuova strada per l’analisi stereoisomerica chirale; riducendo così la necessità di derivatizzazione chirale in alcuni casi. Generazioni più sensibili di strumentazione spettrometrica di massa a triplo quadrupolo con tecnologie di ionizzazione nuove o migliorate stanno spingendo i limiti di rilevamento a bassi livelli di picogrammi, e di conseguenza la richiesta di derivatizzazione chimica per migliorare la sensibilità del saggio (attraverso una migliore ionizzazione o selettività) è diminuita. Altre tecnologie tra cui UHPLC; micro-/nano-LC (per una migliore efficienza di ionizzazione); strumenti TOF con capacità di mobilità ionica (separazione elettronica, piuttosto che chimica/fisica) hanno anche contribuito al declino della derivatizzazione chimica nel laboratorio bioanalitico. Detto questo però, la tecnica viene ancora applicata per separazioni molto complesse dove le tecnologie sopra citate non possono avere un impatto adeguato. A volte l’accoppiamento della derivatizzazione chimica con una di queste tecnologie ha un impatto potenziato/additivo. In particolare, la combinazione di SFC con derivatizzazione chirale ha dimostrato di essere superiore per la separazione chirale rispetto all’analisi SFC (dati non mostrati).

A causa di questo declino della tecnica e della sua complessità rispetto ad altre tecniche analitiche, la derivatizzazione chimica si è evoluta in una “forma d’arte” speciale in laboratorio, che richiede competenze specialistiche combinate con una forte competenza chimica. Di conseguenza, meno scienziati negli ambienti DMPK riescono a padroneggiare la tecnica e a diventare abili nella sua applicazione. La questione diventa quindi come preservare queste abilità e trasmetterle alle future generazioni di scienziati analitici. Problemi speciali come questo, articoli di revisione, capitoli di libri, guida contenente protocolli sperimentali, si spera faciliteranno e promuoveranno l’uso della derivatizzazione chimica come grande strumento analitico.

Outline

Questo numero tematico copre i progressi nelle tecniche di derivatizzazione esistenti utilizzate nella ricerca bioanalitica, così come nuovi metodi e approcci innovativi (ad es, combinazione di derivatizzazione con microflow LC-MS e l’idea di nuove tecniche di tagging chimico di Niwa et al. ).

Il numero mira a coprire aspetti relativi a:

• Metodi di derivatizzazione nella bioanalisi LC-MS (inclusa HPLC);

• Derivatizzazione peptidica per l’analisi di proteine terapeutiche;

• Reagenti di derivatizzazione chirale applicati a campioni biologici (vedi Vashistha et al. );

• Derivatizzazione per l’analisi di composti endogeni (vedi ‘Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in the bioanalysis of endogenous and exogenous compounds” di Barnaby et al. , o “Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses” di Marcos et al. );

• Procedure di derivatizzazione nel controllo del doping umano (vedi interessante review di Athanasiadou et al. ).

Se è vero che la derivatizzazione chimica è solo un altro strumento nella cassetta degli attrezzi bioanalitica, è un “must have” per un laboratorio DMPK e uno che continuerà ad avere un impatto nell’affrontare molte sfide bioanalitiche.

Pertanto, se non ti piace il tuo analita, cambialo (con la derivatizzazione chimica)!