Dephosphorylation

V.B Protein Phosphatases in RPTK Signaling

Tyrosine dephosphorylation is another fast-acting mechanism for the inhibition or termination of signaling from RPTKs. La fosforilazione delle proteine nella trasduzione del segnale è reversibile, e le PTK agiscono di concerto con le PTPasi nel determinare l’inizio, l’estensione e la fine della fosforilazione della tirosina. La downregulation della segnalazione RPTK avviene non solo attraverso la de-fosforilazione diretta della RPTK stessa (cioè, la RPTK è un substrato per la PTPasi), ma anche attraverso la de-fosforilazione di un target cruciale a valle della RPTK. Poiché le proteine fosforilate dalla tirosina, le proteine fosforilate dalla serina e dalla treonina, e anche i fosfolipidi sono mediatori della segnalazione RPTK, ci sono esempi di fosfatasi specifiche per la serina/treonina della proteina e di fosfoinositide-specifiche per i lipidi che mediano la downregulation della segnalazione RPTK. Seguono alcuni esempi, così come una breve descrizione generale delle fosfatasi proteiche.

Tutte le PTPasi identificate contengono un dominio PTPase conservato, lungo ∼280 aminoacidi. La loro attività catalitica specifica è circa 1000 volte superiore e molto meno specifica di quella delle PTK. Come nel caso delle PTK, le PTPasi possono essere divise in PTPasi transmembrana e citoplasmatiche. Le PTPasi transmembrana contengono regioni extracellulari con motivi quali ripetizioni simili alla fibronectina di tipo III, ripetizioni simili alla caderina e domini simili alle immunoglobuline. Hanno una singola regione transmembrana di solito seguita da due domini PTPasi, solo uno dei quali sembra contribuire all’attività catalitica. Come la loro regione extracellulare indicherebbe, alcune PTPasi transmembrana, come PTPκ e PTPμ, sono coinvolte nell’adesione cellula-cellula omofila, e PTPμ può stabilizzare i contatti cellula-cellula defosforilando le catenine e le cadherine. Queste e altre PTPasi transmembrana non sono state implicate nella defosforilazione diretta delle RPTKs, in contrasto con le PTPasi citoplasmatiche, di cui diverse sono capaci di defosforilare direttamente le RPTKs.

La proteina tirosina fosfatasi citoplasmatica ematopoietica SHP-1 è una delle due sole PTPasi con dominio SH2 identificate. SHP-1 si lega alle RPTK attivate, come CSF-1 e il recettore Kit/SCF, attraverso uno dei suoi due domini SH2. Il legame SH2 di SHP-1, e della strutturalmente correlata SHP-2 (vedi più avanti), allevia un vincolo autoinibitorio sul dominio della PTPasi. Di conseguenza, è stato dimostrato che sia il CSF-1 che i recettori Kit/SCF sono substrati diretti per SHP-1 e che SHP-1 è importante per la normale downregolazione della segnalazione dei recettori Kit e CSF-1. Questo ha anche una rilevanza fisiologica. Quindi, i topi con il fenotipo motheaten (me), che è dovuto a mutazioni naturali di perdita di funzione (LOF) in SHP-1, hanno numerose anomalie ematopoietiche dovute all’iperproliferazione di cellule mieloidi/monocitiche e mastociti. La segnalazione deregolata dei recettori CSF-1 e Kit è pensata per causare questi difetti, il che è supportato da studi che dimostrano che il fenotipo dei topi mutanti dominanti white-spotting (W), che hanno mutazioni LOF naturali in Kit, è alleviato dall’incrocio con i topi mutanti me, e viceversa. Questi e più recenti dati che mostrano trascrizioni alternative che causano troncamenti di SHP-1 o mutazioni frameshift con conseguente perdita di SHP-1 in linee cellulari tumorali primarie che esprimono Kit stabilite da pazienti leucemici, indicano che SHP-1 è un soppressore tumorale.

La proteina tirosina fosfatasi PTP1B è un’altra fosfatasi citosolica, che è coinvolta nella downregulation diretta della segnalazione RPTK. PTP1B si lega ai recettori di insulina e IGF-1 attivati attraverso il suo dominio catalitico N-terminale attraverso un meccanismo sconosciuto. Dopo il legame, PTP1B defosforila direttamente il recettore dell’insulina stesso e la sua principale proteina di aggancio associata, il substrato del recettore dell’insulina-1 (IRS-1). Di conseguenza, la delezione mirata di PTP1B nei topi causa l’iperfosforilazione del recettore dell’insulina e di IRS-1 e la sensibilizzazione della segnalazione dell’insulina. PTP1B inoltre defosforila STAT5a e STAT5b, impedendo così la loro traslocazione nucleare e l’attività trascrizionale. STAT5a e STAT5b sono fosforilati dalle JAK attivate dai recettori delle citochine, ma sono anche fosforilati direttamente da diverse RPTKs.

Tuttavia, PTP1B, così come il recettore-simile PTPα, e SHP-2, un’altra fosfatasi contenente il dominio SH2, sono stati anche implicati nel rafforzamento della segnalazione a valle delle RPTKs. PTP1B è sovraespresso in linee cellulari di cancro al seno dove causa la defosforilazione di Tyr527 al terminale C di c-Src. Questo porta a una maggiore attività della chinasi Src, poiché la fosforilazione di questo sito è inibitoria per l’attività di Src attraverso un meccanismo allosterico e autoinibitorio. La RPTPα transmembrana è fosforilata in vivo alla tirosina Tyr789, che crea un sito di legame per c-Src, permettendo alla RPTPα di defosforilare Tyr527 in Src in vitro. È interessante notare che sia il legame che la defosforilazione di Src dipendono dalla fosforilazione a Tyr789, e un meccanismo di spostamento della fosfotirosina è stato proposto per l’attivazione di Src da RPTPα. Di conseguenza, i mutanti chinasi-defettivi o Tyr789Phe di RPTPα abrogano la trasformazione neoplastica da RPTPα sovraespresso, e la rottura mirata di RPTPα causa una diminuita attività dei membri della famiglia Src nelle cellule dei topi mutanti, che si correla con un aumento dei livelli di fosforilazione di Tyr527. SHP-2, che è ubiquitariamente espresso, si associa in vivo attraverso i suoi domini SH2 con numerosi substrati RPTKs e PTK, compresi i recettori per PDGF, EGF, insulin-like growth factor-1 (IGF-1), e SCF, così come la proteina di aggancio IRS-1. SHP-2 diventa tirosina fosforilata in risposta alla stimolazione con diversi fattori di crescita, e SHP-2 tirosina-fosforilato si lega ai recettori per PDGF o SCF, così come la molecola adattatore Grb2. La SHP-2 legata, a sua volta, ha dimostrato di defosforilare selettivamente i residui di tirosina nel PDGFR-β importanti per il legame di PI 3′-chinasi e il GAP per Ras. Inoltre, la microiniezione di anticorpi bloccanti per SHP-2 o l’espressione di domini SHP-2 SH2 o di SHP-2 cataliticamente inattivo inibisce la mitogenesi stimolata da EGF, insulina e IGF-1. Questi risultati suggeriscono che SHP-2 è un attivatore a monte della segnalazione di Ras e altre vie di segnalazione regolate da Grb2 ed è forse un modulatore della segnalazione di PI 3′-chinasi indotta da RPTK. Simile a SHP-1, il legame di SHP-2 potrebbe attivare la sua funzione catalitica. SHP-2 è anche affermato di defosforilare Tyr527 nel terminale C di Src, che fornisce un’ulteriore regolazione positiva della segnalazione.

Diverse proteine serina/treonina chinasi e i loro substrati sono defosforilati dalla principale fosfatasi serina/treonina-specifica PP2A. Si tratta di una fosfatasi eterotrimerica citoplasmatica e nucleare, composta da una subunità A strutturale, una subunità B regolatrice e una subunità C catalitica. PP2A è legata a numerose proteine scaffold attraverso la sua subunità regolatrice, e la sua attività è strettamente regolata nel contesto degli scaffold assemblati. Uno dei substrati importanti nella segnalazione RPTK è la PI 3′-chinasi bersaglio Akt, una proteina serina/treonina chinasi che media la sopravvivenza cellulare in parte attraverso la fosforilazione del membro della famiglia Bcl-2 Bad. PP2A defosforila il sito di fosforilazione attivante T308 in Akt, cruciale per l’attività della chinasi. Inoltre, PP2A potrebbe defosforilare la molecola antiapoptotica Bcl-2, abrogando la sua funzione di sopravvivenza. Sono stati identificati numerosi altri substrati per PP2A, molti dei quali sono importanti bersagli a valle delle RPTK.

Due fosfoinositide-specifiche fosfatasi, PTEN e SHIP1/2, rispettivamente, defosforilano specificamente la posizione D-3 e D-5 dell’anello di inositolo in PtdIns(3,4,5)P3, uno dei principali effettori della segnalazione delle PI 3′-chinasi. Questo contrasta la segnalazione di PI 3′-chinasi avviata da RPTK e, di conseguenza, PTEN ha dimostrato di essere un gene soppressore di tumori umani frequentemente mutato. Mutazioni inattivanti in PTEN sono strumentali in alcuni tumori neuronali, della mammella e delle cellule germinali nell’uomo, che è associato ad un aumento dell’attività di Akt.