Cromatografia di filtrazione su gel

Applicazioni della cromatografia di filtrazione su gel

La cromatografia di filtrazione su gel, un tipo di cromatografia di esclusione dimensionale, può essere usata per frazionare molecole e complessi in un campione in frazioni con un particolare intervallo di dimensioni, per rimuovere tutte le molecole più grandi di una particolare dimensione dal campione, o una combinazione di entrambe le operazioni. La cromatografia di filtrazione su gel può essere usata per separare composti come piccole molecole, proteine, complessi proteici, polisaccaridi e acidi nucleici quando sono in soluzione acquosa. Quando un solvente organico è usato come fase mobile, il processo è invece indicato come cromatografia a permeazione di gel.

La cromatografia a filtrazione su gel può essere utilizzata anche per:

• Frazionamento di molecole e complessi entro un intervallo di dimensioni predeterminato
• Analisi e determinazione delle dimensioni
• Rimozione di grandi proteine e complessi
• Scambio di tamponi
• Desaltazione
• Rimozione di piccole molecole come nucleotidi, primers, coloranti, e contaminanti
• Valutazione della purezza del campione
• Separazione dei radioisotopi legati da quelli non legati

I mezzi cromatografici di filtrazione su gel per tutti gli usi di cui sopra sono disponibili in colonne a flusso di gravità preconfezionate, colonne di spin, colonne cromatografiche a bassa e media pressione e resine in bottiglia.

Meccanismo della cromatografia a filtrazione su gel

In una colonna cromatografica a filtrazione su gel, la fase stazionaria è composta da una matrice porosa, e la fase mobile è il tampone che scorre tra le perle della matrice. Le perline hanno una gamma di dimensioni dei pori definita, nota come gamma di frazionamento. Le molecole e i complessi che sono troppo grandi per entrare nei pori rimangono nella fase mobile e si muovono attraverso la colonna con il flusso del buffer. Le molecole e i complessi più piccoli che sono in grado di entrare nei pori entrano nella fase stazionaria e si muovono attraverso la colonna di filtrazione del gel con un percorso più lungo attraverso i pori delle perline.

Ogni molecola o complesso che è al di sopra della gamma di frazionamento per una particolare colonna di cromatografia a filtrazione del gel si muove attraverso la colonna più velocemente di qualsiasi molecola che può entrare nella fase stazionaria. Pertanto, qualsiasi costituente nel campione che è al di sopra dell’intervallo di frazionamento eluirà per primo (nel volume vuoto) prima di qualsiasi cosa che è nell’intervallo di frazionamento. La dimensione minima che rimane nella fase mobile e non entra nella fase stazionaria è nota come limite di esclusione. Bio-Rad offre supporti per cromatografia a filtrazione su gel e colonne con limiti di esclusione che vanno su tre ordini di grandezza, da 100 dalton a 100.000 dalton (100 kDa).

Le molecole e i complessi che possono entrare nella fase stazionaria saranno frazionati in base alle loro dimensioni. Le molecole più piccole migreranno in profondità nei pori e saranno ritardate più delle molecole più grandi che non entrano così facilmente nei pori, e quindi vengono eluite dalla colonna più rapidamente. Questa differenza nella migrazione dei pori porta al frazionamento dei componenti per dimensione con il più grande che eluisce per primo.

Nelle colonne cromatografiche di filtrazione del gel progettate per la desalinizzazione, lo scambio del tampone e la rimozione di piccole molecole come i nucleotidi, i sali e i piccoli composti entrano facilmente nei pori, sono ritardati e migrano più lentamente attraverso la colonna che le proteine o gli acidi nucleici più grandi. Pertanto, i componenti di interesse nel campione vengono eluiti prima di sali, nucleotidi, ecc. I kit di pulizia del DNA che utilizzano questo meccanismo spesso contengono colonne di spin per la filtrazione del gel.

La risoluzione, qui definita come la nitidezza dei confini tra le frazioni di dimensione, è determinata dalla dimensione delle perle e da una serie di altri fattori. Una dimensione più piccola delle microsfere generalmente produce una risoluzione più alta in una colonna cromatografica di filtrazione su gel. Le molecole compatte si diffondono attraverso la fase stazionaria più velocemente delle molecole lineari. L’esclusione dimensionale, l’intervallo di frazionamento e la velocità di eluizione sono influenzati dalla composizione del tampone, dalla forza ionica e dal pH. Per il frazionamento di miscele complesse di proteine, i tempi di eluizione e i limiti di esclusione dimensionale possono dover essere determinati empiricamente.

Cromatografia di filtrazione su gel

Un criterio importante per i mezzi di cromatografia di filtrazione su gel è che i mezzi siano inerti e che nulla nel campione o nel tampone si leghi ai mezzi. Un’altra considerazione è il tipo di colonna di filtrazione su gel utilizzata e se è usata in un sistema di cromatografia pressurizzato o in colonne a flusso di gravità o di spin. Se viene usato un sistema di cromatografia pressurizzato, sia la colonna che i media devono essere in grado di tollerare la pressione e le portate utilizzate.

I media comunemente usati per la cromatografia di filtrazione su gel sono basati su perline di agarosio o poliacrilammide, destrosio per sistemi a gravità o a bassa pressione, e resine polimeriche per sistemi a media pressione. La scelta dei media dipende dalle proprietà dei componenti da separare e da altri fattori sperimentali. Le seguenti sono considerazioni generali per determinare la scelta dei mezzi di cromatografia a filtrazione su gel:

• Gamma di frazionamento
• Limite di esclusione delle dimensioni
• Pressione operativa
• Rete di flusso
• Viscosità del campione
• Gamma di pH
• Autoclavabilità
• Tolleranza per solventi organici miscibili con acqua; alcuni campioni possono essere più solubili in una miscela acqua-organica
• Tolleranza ai detergenti, agenti caotropici, formammide, ecc.
• Temperatura operativa

I tipi di campioni, la scelta dei media e la configurazione del sistema cromatografico determineranno quali parametri sono i più importanti per una data applicazione di purificazione.