Collagenasi A

Descrizione generale

La collagenasi è una proteasi che taglia la proteina a tripla elica chiamata collagene. Il Clostridium histolyticum produce sei tipi di collagenasi: α, β, γ, δ, ε e λ. Queste collagenasi sono attive contro il tessuto connettivo e mostrano più reattività verso la gelatina che verso il collagene. La collagenasi ottenuta da Clostridium histolyticum ha un’attività molto forte, in quanto digerisce il collagene da entrambe le estremità, a temperature fino a 4-10 °C.

Specificità

La collagenasi degrada il collagene nativo. La clostripina, gli enzimi simili alla tripsina e le proteasi neutre degradano anche altre proteine.
Attività enzimatica:
Attività collagenasi: >0,15U/mg (secondo Wünsch) (+25°C, 4-fenil-azobenzil-ossicarbonil-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg come substrato)
Attività enzimatica contaminante: tripsina, clostripina e attività proteolitica neutra
La collagenasi A ha un rapporto equilibrato di attività enzimatica.

Applicazione

La collagenasi da C. histolyticum è ampiamente utilizzata per la disaggregazione di molti tipi di tessuti (ad esempio, polmone, cuore, muscolo, osso, tessuto adiposo, fegato, rene, cartilagine, ghiandola mammaria, placenta, vasi sanguigni, cervello, tumori, cordone ombelicale) e per la preparazione di sospensioni di singole cellule per la creazione di sistemi di coltura cellulare primaria. La collagenasi A è raccomandata quando la resa, la vitalità e la funzionalità sono importanti.
La collagenasi di Roche è stata usata per preparare cellule da molti tipi di tessuto, come epatociti, adipociti, isole pancreatiche, cellule epiteliali, cellule muscolari, cellule endoteliali, ecc. Tuttavia, l’idoneità di ogni lotto dell’enzima per la distruzione di un particolare tessuto deve essere determinata empiricamente.

Definizione unità

Contenuto
Liofilizzato, non sterile

Definizione unità: La collagenasi di Roche viene dosata in unità Wünsch (1 μmol di prodotto formato al minuto a +25 °C con substrato Wünsch).
Frequentemente, le attività della collagenasi sono indicate in unità Mandl (1 μmol di leucina liberata dal collagene in 5 ore a +37 °C).
Purtroppo, non esiste un fattore di conversione coerente tra le due unità di attività, poiché l’unità Mandl dipende, in parte, dalla concentrazione di proteasi contaminanti nella preparazione di collagenasi, una variabile indefinibile. Una preparazione di collagenasi più pura fornirebbe effettivamente un’attività specifica inferiore in unità Mandl rispetto a una preparazione grezza. Le preparazioni di Clostridium danno tipicamente fattori di conversione di circa 1:1800 (ad esempio, un particolare lotto di collagenasi Clostridium conteneva circa 0,15 Wünsch U/mg e 250 Mandl U/mg).

Nota di preparazione

Attivatore: Ca2+
Inibitori:
Inibitori della collagenasi: EDTA, EGTA, Cys, His, DTT, 2-mercapto-etanolo
La collagenasi non è inibita dal siero: TLCK
Inibitori della tripsina: aprotinina, inibitore della tripsina (albume, soia), siero
Concentrazione di lavoro: 0,5 a 2,5 mg/ml
Condizioni di conservazione (soluzione di lavoro): -15 a -25 °C
Roche raccomanda di ricostituire solo la quantità di liofilizzato necessaria per l’uso immediato. La soluzione ricostituita può essere conservata a -15 a -25 °C per un massimo di una settimana. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti poiché l’attività diminuisce dopo la ricostituzione.

Ricostituzione

Ricostituzione in qualsiasi soluzione salina bilanciata (es. HBSS)

Altre note

Solo per la ricerca scientifica. Non per l’uso in procedure diagnostiche.

Le condizioni di spedizione possono variare

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