Camptothecin

3.1 Introduzione

Camptothecin (CPT) è un alcaloide indolico monoterpenico che è stato isolato per la prima volta da Camptotheca acuminata da Monroe Wall e Mansukh Wani alla divisione di introduzione delle piante dell’USDA a metà del 1958 (Wall et al., 1966). C. acuminata è un albero originario della Cina e la sua corteccia è usata nella medicina tradizionale cinese da tempo immemorabile. Gli eventi della scoperta della CPT sono stati ben rivisti da Wall e Wani (1996) i co-scopritori della CPT e del Taxolo. Più tardi, negli anni ’50 e fino alla fine degli anni ’60, le potenti attività antitumorali della CPT hanno spinto gli scienziati a studiare la sintesi chimica totale e a convalidare il suo potenziale con studi preclinici e clinici (Schultz, 1973). L’efficacia della CPT fu studiata negli Stati Uniti conducendo studi clinici di fase I (Gottlieb e Luce, 1972; Muggia et al., 1972) e di fase II (Moertel et al., 1972). L’uso clinico della CPT era evidente in Cina per il trattamento del cancro allo stomaco e alla vescica e alcuni tipi di leucemia, spesso in combinazione con i corticosteroidi (Pettit, 1976). I primi studi hanno indicato che la forma carbossilata solubile in acqua della CPT (sale di sodio della CPT) ha mostrato alcuni risultati positivi contro il cancro al collo o alla vescica in Cina (Xu, 1980). Tuttavia, i risultati degli studi clinici condotti negli Stati Uniti utilizzando la forma carbossilata della CPT non sembravano essere altrettanto promettenti contro il cancro. Questa incongruenza potrebbe essere attribuita al fatto che gli studi clinici americani includevano solo pazienti che avevano già mostrato resistenza ad altri trattamenti. Tuttavia, la mancanza di un’efficacia consistente della forma carbossilata della CPT negli studi clinici ha spinto i ricercatori a concentrarsi sulla forma lattonica della CPT per migliorare ulteriormente i farmaci. Tuttavia, gli studi clinici con le CPT furono essenzialmente interrotti negli anni ’70 a causa dell’incapacità di risolvere la proprietà insolubile in acqua della CPT nella forma lattone, i bassi tassi di risposta e l’alta tossicità come la mielosoppressione, le tossicità gastrointestinali e la cistite emorragica (Horwitz, 1975; Rozencweig et al., 1976)

Anche se gli studi clinici sulla CPT terminarono negli anni ’70, gli studi sul suo meccanismo di azione continuarono negli anni successivi. Il team di marito e moglie dei dottori Marshall e Susan Horwitz all’Albert Einstein College of Medicine, così come altri, ha fatto le prime scoperte relative al meccanismo d’azione della CPT. I loro studi hanno rivelato che la CPT inibisce la sintesi del DNA e dell’RNA (compreso l’RNA ribosomiale) e induce danni al DNA (Horwitz et al., 1971; Kessel, 1971; Abelson e Penman, 1972; Wu et al., 1971; Horwitz e Horwitz, 1973). Questi scienziati hanno osservato che la CPT è più potente durante la fase S del ciclo cellulare e hanno previsto che l’intervento durante la replicazione del DNA potrebbe avere un ruolo nella morte cellulare indotta dalla CPT. Studi successivi hanno indicato che la CPT arresta il ciclo cellulare in entrambe le fasi S e G2, che sono le cause della citotossicità della CPT (Tsao et al., 1992; Goldwasser et al., 1996). Durante i primi anni ’80, un certo numero di agenti dannosi per il DNA non correlati sono stati esplorati clinicamente per trattare il cancro e le infezioni batteriche. Gli studi hanno rivelato due diverse classi di farmaci dannosi per il DNA come gli antibiotici chinolonici (cinoxacina, acido nalidixico e ciprofloxacina) e i derivati della podofillotossina (etoposide e teniposide) che sono risultati essere dannosi per il DNA. Entrambe le classi di farmaci condividevano lo stesso meccanismo d’azione, cioè l’inibizione della topoisomerasi II (Top2), un enzima attivo durante la fase S che assiste il fenomeno della replicazione del DNA (Froelich-Ammon e Osheroff, 1995). Notando questo il team del Dr. Leroy F. Liu alla John Hopkins, in collaborazione con i laboratori francesi Smith Kline & di Philadelphia, ha testato se la CPT ha anche un’attività simile per indurre la morte cellulare. Con loro sorpresa, 125 µM CPT non è riuscito a inibire la scissione del DNA dipendente da Top2. Tuttavia, quando hanno testato altri enzimi associati alla replicazione del DNA, hanno osservato un’induzione potente e dose-dipendente del danno al DNA in presenza della topoisomerasi I (Top1) (Hsiang et al., 1985). Gli ortologhi di Top1 si trovano in tutti gli eucarioti e sembrano essere un enzima essenziale durante lo sviluppo in un’ampia varietà di animali. Per esempio, l’eliminazione di Top1 durante le prime fasi dello sviluppo è letale sia per Mus musculus (Morham et al., 1996) che per Drosophila melanogaster (Zhang et al., 2000a,b). DNA Top1 è l’enzima responsabile del rilassamento del DNA superavvolto durante il processo di replicazione e trascrizione del DNA. In particolare Top1 prima taglia il DNA superavvolto per introdurre una rottura a singolo filamento, o nick, nel DNA e si lega covalentemente all’estremità 3′ del DNA intaccato e permette al filamento intaccato al 5′ di ruotare intorno al filamento intatto in modo controllato. Dopo la rotazione, Top1 religa il filamento intaccato (Koster et al., 2005). Questa formazione del complesso Top1-DNA durante la replicazione del DNA viene comunemente chiamata “complesso covalente Top1”, a causa del legame covalente tra Top1 e il filamento intaccato (Pommier, 2006). La CPT e gli analoghi della CPT richiedono l’inibizione dell’attività di Top1 (Eng et al., 1988; Nitiss e Wang, 1988), con conseguente morte cellulare. Nella cellula, CPT si integra nel complesso covalente Top1/DNA, formando un complesso ternario. Quindi sia Top1 che il DNA sono necessari per l’attività, e CPT non mostra capacità di legame in assenza di uno dei due (Leteurtre et al., 1993). La CPT si lega sia all’enzima Top1 che al filamento di DNA intatto attraverso un legame a idrogeno e impedisce sia la reiscrizione del DNA intaccato che la dissociazione di Top1 dal DNA. Durante la replicazione, questo complesso ternario CPT agisce come un blocco stradale per la forcella di replicazione. La collisione tra il complesso ternario e la forcella di replicazione causa uno stress da taglio sul filamento di DNA intatto, con conseguente rottura e morte cellulare. Il bersaglio noto della CPT e dei suoi analoghi è il complesso Top1-DNA. Tuttavia, come menzionato sopra, è stato dimostrato che la CPT colpisce anche la sintesi di proteine, RNA e DNA, il che suggerisce che la CPT potrebbe avere altri bersagli cellulari. L’attività inibitoria della CPT è ulteriormente confermata quando le cellule di lievito con Top1 eliminato diventano funzionalmente immuni alla CPT e ai suoi analoghi, e le cellule tumorali mammifere o umane diventano resistenti alle CPT quando Top1 è mutato (Gongora et al., 2011; Urasaki et al., 2001; Benedetti et al., 1993; Chang et al., 2002; Arakawa et al., 2013; Jensen et al., 2016). La sovraespressione di un mutante Top1 (Yanase et al., 1999) si traduce in un aumento dell’attività della sensibilità alla CPT di Top1 (Wu et al., 2014). La modalità d’azione più ampiamente studiata e documentata della CPT e dei suoi analoghi è l’inibizione del DNA. Tuttavia, nella presente revisione vengono discussi vari altri bersagli cellulari e molecolari della CPT che sono anche responsabili dell’attività antitumorale.