Analisi evolutiva del gene gyrA dei ceppi batterici di Neisseria meningitidis del complesso clonale 4821 raccolti in Cina tra il 1978 e il 2016

Analisi evolutiva di 77 sequenze nucleotidiche gyrA dei ceppi CC4821 N.meningitidis

Sono state analizzate settantasette sequenze gyrA de novo di CC4821 N.meningitidis nel contesto di 149 sequenze gyrA pubblicamente disponibili (elencate nella tabella aggiuntiva 1). Un albero filogenetico neighbor joining è stato costruito con il dataset risultante di 226 sequenze nucleotidiche di gyrA (Fig. 1). Un albero simile è stato ottenuto utilizzando il metodo della massima verosimiglianza (ML) (Figura 1 supplementare). Le sequenze nucleotidiche erano significativamente divergenti con una distanza p complessiva di 0,045 (Tabella 1). Una panoramica dell’albero ha mostrato che le sequenze da CC4821 ceppi N.meningitidis (in rosso in Fig. 1) sono stati trovati attraverso l’albero dimostrando che il gene gyrA era relativamente divergente all’interno di questi ceppi.

Neighbor joining albero filogenetico di 226 sequenze del gene gyrA da ceppi Neisseria. Il nome del ceppo è indicato come segue: nome della specie-GB ID-ceppo ID-ST-CC-Serogruppo-paese di raccolta-anno di raccolta-fenotipo di resistenza-CIP. Le informazioni mancanti sono indicate da uno spazio vuoto. Per esempio, N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Germania-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Corea del Sud-2017. I nomi delle sequenze dei ceppi di N.meningitidis CC4821 sono indicati in rosso. Le 77 sequenze generate in questo studio sono sottolineate. Le sequenze di 9 ceppi di riferimento sono indicate con un punto nero. I valori di bootstrap > 70% sono indicati. I valori di bootstrap < 70% sono indicati tra parentesi quando necessario. I 9 gruppi genetici identificati in questo studio sono indicati come linee verticali tra parentesi. Il fenotipo di resistenza CIP è indicato con R per resistenza, S per sensibile e I per fenotipo di resistenza intermedio

Tra le 226 sequenze analizzate, quasi il 62% delle sequenze (140) sono state trovate in cima all’albero, senza un valore di bootstrap significativo (Fig. 1). Queste sequenze erano altamente omogenee, con una p-distanza di 0,003 (Tabella 1). Le restanti 86 sequenze erano più divergenti, con una p-distanza di 0,066 rispetto alle sequenze raggruppate in cima all’albero. La maggior parte dei nodi riguardanti queste 86 sequenze presentavano un valore di bootstrap > 70%. Inoltre, la p-distanza all’interno di questo gruppo di 86 sequenze era di 0,09 dimostrando che queste sequenze erano altamente divergenti tra loro. Poiché i nodi principali dell’albero presentavano un valore di bootstrap > 80%, abbiamo deciso di assegnare arbitrariamente le sequenze a 9 diversi gruppi genetici (Fig. 1; Tabella 1). Questi 9 gruppi sono stati trovati anche nell’albero ML (Figura 1 supplementare). Le sequenze gyrA dei ceppi CC4821 sono state trovate in 6 di questi gruppi genetici, vale a dire il gruppo 1, 2, 3, 5, 6 e 8.

Il gruppo 1 era composto da 2 sequenze, N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Questo gruppo è stato sostenuto da un bootstrap del 100% che suggerisce che queste 2 sequenze erano molto diverse dal resto delle sequenze. Le sequenze condividevano 7 cambiamenti amminici (Tabella 1, Tabella aggiuntiva 2). Tuttavia, il lungo ramo corrispondente alla sequenza N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 ha suggerito che anche questa sequenza era significativamente divergente da N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e questo è stato confermato da una p-distanza di 0,06 tra queste 2 sequenze (Tabella 1).

Gruppo 2 consisteva di 2 sequenze da N.meningitidis raccolte nelle province di Gansu e Guangxi in Cina nel 2007 e 2011, vale a dire N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R e N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

Il gruppo 3 consisteva in una singola sequenza, cioè N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Il nodo corrispondente a questa sequenza era supportato da un valore di bootstrap dell’80%. Inoltre, la più bassa p-distanza di coppia tra questa sequenza e le altre sequenze analizzate era 0,032 dimostrando che questa sequenza era significativamente divergente rispetto al resto delle sequenze analizzate (Tabella 1).

Il gruppo 5 consisteva di 26 sequenze, principalmente da N.meningitidis tra cui 9 di CC4821. Un sottogruppo di 7 sequenze supportate da un bootstrap del 100% presentava 5 sequenze da N.lactamica. È interessante notare che N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 si è raggruppato con sequenze di N.lactamica con un bootstrap del 100% e un lungo ramo.

Il gruppo 6 consisteva di 27 sequenze di N.meningitidis (8 di CC4821) e 1 sequenza di N. cinerea, cioè N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294, che condivideva un nodo con N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R. Tuttavia, la sequenza di N.cinerea presentava un lungo ramo che suggeriva una divergenza significativa rispetto alla sequenza di N.meningitidis. Sulla base dei dati disponibili, le sequenze del gruppo 6 sembravano provenire da ceppi resistenti a CIP. Tuttavia, nessuna sostituzione aminoacidica unica è stata condivisa da questi ceppi, suggerendo che non c’era un marcatore comune per il fenotipo di resistenza di questi ceppi (Tabella supplementare 2).

Il gruppo 8 conteneva la maggior parte delle sequenze di N.meningitidis (64%) analizzate in questo rapporto. I ceppi sono stati raccolti negli ultimi 88 anni in 13 diversi paesi di 4 continenti. Nonostante l’intervallo di tempo significativo e la diffusione geografica, queste sequenze erano altamente conservate con una p-distanza di 0,003. Inoltre, queste sequenze provenivano da ceppi di 68 ST, 24 CC, 9 sierogruppi, compreso il ceppo di riferimento 053442. Nel complesso, queste osservazioni hanno mostrato che il gene gyrA era altamente conservato tra la maggior parte dei ceppi di N.meningitidis nonostante le diverse caratteristiche genetiche, le posizioni geografiche o il tempo di raccolta.

Analisi della divergenza all’interno della proteina GyrA

La divergenza degli aminoacidi all’interno della proteina GyrA è stata analizzata tra 129 sequenze uniche (Tabella 2 supplementare). Duecentocinquantasette posizioni divergenti sono state identificate tra i 931 aminoacidi presenti nell’allineamento (Fig. 2). Anche se questi siti sono stati trovati in tutta la proteina, la distribuzione della divergenza non sembrava essere casuale. Infatti, due regioni erano altamente conservate, dalle posizioni 530 a 620, e una regione più piccola tra 300 e 330. Secondo la proteina di E.coli, la prima regione corrisponde alla fine del dominio terminale amminico e all’inizio del dominio terminale carbossilico. La seconda regione corrisponde al dominio della torre della proteina in base alla struttura del modello 3D (Fig. 2).

Divergenza degli aminoacidi della proteina GyrA basata su 129 sequenze uniche. Le posizioni all’interno dell’allineamento lungo 932 aminoacidi sono indicate sull’asse X. La percentuale di sequenze caratterizzate da una particolare posizione divergente è indicata sull’asse Y (lato sinistro). Per esempio, il 58% delle sequenze presenta una mutazione in posizione 91. Il diagramma di divergenza è stato generato dalla tabella delle differenze aminoacidiche mostrata nella tabella aggiuntiva 2. L’allineamento presenta 10 lacune e il numero di sequenze con lacune è indicato sull’asse destro e mostrato come un quadrato nero. Una mappa di E.coli GyrA proteina con domini strutturali e funzionali è mostrato in basso per il confronto. La mappa è stata generata sulla base dei seguenti riferimenti. La sequenza della proteina GyrA di E.coli e N.meningitidis ceppo di riferimento 053442 (GB-ID CP000381) sono stati confrontati (Additional Table 4). Il sito noto resistente al CIP in E.coli è mostrato e le posizioni corrispondenti in N.meningitidis sono indicate con una linea blu. Vale la pena notare che tra gli 8 siti resistenti riportati in E.coli, solo le posizioni 83 e 87 sono divergenti in N.meningitidis (siti 91 e 95)

Tra le 257 posizioni divergenti, nessuna era condivisa da tutte le sequenze gyrA analizzate dei ceppi CC4821. Cinque siti (91, 417, 665, 210 e 288) erano altamente divergenti, il 40% o più delle 129 sequenze erano mutate in queste posizioni. Per esempio, il 48% delle 129 sequenze presentava un residuo mutato in posizione 417 (Fig. 2). Una posizione (91) sembra essere legata alla resistenza a CIP, tutti i ceppi che non erano sensibili a CIP erano mutati in questa posizione, con una I o una F o una V (Tabella supplementare 2).

Identificazione di potenziali marcatori di resistenza a CIP

Tra le 226 sequenze analizzate, 174 provenivano da ceppi testati per la resistenza a CIP (Tabella supplementare 1). Sessantasette ceppi sono stati testati per questo studio. Come menzionato sopra, tutti i ceppi che non erano sensibili a CIP (sia con un fenotipo resistente (R nell’albero) o intermedio (I nell’albero)) erano mutati in posizione 91. Ciò ha dimostrato che una mutazione in posizione 91 era legata al meccanismo di resistenza. Tra i 67 ceppi testati in questo studio, 49 erano mutati in posizione 91, ma 23 di questi ceppi avevano un fenotipo di resistenza intermedio. Ciò ha suggerito che altre posizioni potrebbero essere coinvolte nel meccanismo di resistenza. Al fine di identificare ulteriori potenziali marcatori di resistenza, i 226 ceppi sono stati ulteriormente analizzati in ogni posizione mutata. Un cambiamento che sarebbe stato trovato in ceppi resistenti (compreso il fenotipo di resistenza intermedio) ma non trovato in nessun ceppo sensibile si sarebbe qualificato. Tuttavia, per aumentare la severità dell’analisi, una mutazione trovata in un solo ceppo non sarebbe stata considerata. Complessivamente, sono stati identificati 33 siti (Tabella aggiuntiva 3; lato sinistro della Tabella aggiuntiva 4). Per esempio, H8N è stato trovato in 18 ceppi resistenti (inclusi 2 con fenotipo intermedio) ma non presente in nessun ceppo sensibile. Tutti i 226 ceppi sono stati analizzati per queste 33 posizioni. Ancora una volta, per aumentare la severità dell’analisi, una mutazione trovata in almeno un ceppo sensibile sarebbe stata scartata. Così, la mutazione D95N trovata in ceppi resistenti e sensibili non è stata ulteriormente considerata. Complessivamente, sono state analizzate 39 mutazioni (alcune nella stessa posizione come la posizione 91) (in verde sul lato sinistro della tabella aggiuntiva 4). Un profilo di mutazione è stato costruito per i 128 ceppi con almeno una mutazione di interesse (Tabella aggiuntiva 3). Sono stati identificati quarantasei profili diversi, il che significa che c’erano 46 combinazioni di queste 39 mutazioni tra tutti i ceppi analizzati (lato destro della Tabella 4 supplementare). Sedici dei 46 profili di mutazione riguardavano i ceppi CC4821 (numeri in rosso nella tabella supplementare 4). Ventisei profili riguardavano ceppi che erano noti per essere resistenti alla CIP (nomi dei ceppi in carattere blu nella tabella aggiuntiva 4). Tra i 39 potenziali marcatori di resistenza, le mutazioni N103D e T91I erano le più condivise nei profili con 29 e 27 presenze rispettivamente. Tuttavia, vale la pena notare che anche altre mutazioni erano ben rappresentate come H8N, I111V, E793Q e A679S con 23, 21, 18 e 17 presenze rispettivamente. Vale anche la pena notare che il 45% dei ceppi resistenti (58 su 128) presentava solo la mutazione T91I. Poiché i marcatori di resistenza sono stati inizialmente descritti in E.coli, un confronto tra le sequenze gyrA di E.coli e il ceppo di riferimento N.meningitidis 53,442 è stato necessario per verificare la posizione di questi marcatori nella sequenza di E.coli (Tabella supplementare 5).

Ricombinazione all’interno del gene gyrA tra N. spp.

L’analisi filogenetica ha identificato potenziali ricombinanti. Per esempio, il gruppo 1 era di particolare interesse, riguardante N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 e N.subflava-CP031251.1-M18660. Queste 2 sequenze hanno condiviso 7 cambiamenti di residui, non visti in altri ceppi. Inoltre, 5 di questi cambiamenti sono stati visti entro 30 aminoacidi (Tabella 1). Infine, i cambiamenti di aminoacidi osservati in un ceppo non sono stati visti nell’altro ceppo, come la posizione 740 e 750. Tutte queste osservazioni hanno suggerito una ricombinazione tra questi 2 ceppi che è stata confermata da un’analisi BootScan (Fig. 3a). Altre tre potenziali ricombinazioni sono state confermate da BootScan. La Fig. 3b ha descritto una ricombinazione tra un ceppo CC4821 (probabilmente N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 o N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) e N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —–. La Fig. 3c presenta eventi multipli di ricombinazione tra N.lactamica-CP031253.1-M17106—– e due ceppi di N.meningitidis, N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– e N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R. Infine, una ricombinazione tra i ceppi N.meningitidis è stato caratterizzato in Fig. 3d. Complessivamente, l’analisi di ricombinazione ha mostrato che il gene gyrA dei ceppi di Neisseria è altamente incline alla ricombinazione.

Potenziali eventi di ricombinazione inter- e intra-specie tra ceppi di Neisseria. a. Ricombinazione tra N.subflava e N.meningitidis. Un grafico BootScan è stato generato in SimPlot con N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 come query. b. Ricombinazione tra N.cinerea e N.meningitidis. Un grafico BootScan è stato generato in SimPlot con N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R come query. c. Ricombinazione tra N.lactamica e N.meningitidis. Un grafico BootScan è stato generato in SimPlot con N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 come query. d. Ricombinazione tra ceppi di N.meningitidis. Un grafico BootScan è stato generato in SimPlot con N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 come query. Il ceppo che si prevede contribuisca maggiormente al processo di ricombinazione (backbone) è mostrato come una linea rossa. Il ceppo di riferimento N.meningitidis 053442 (GB ID CP000381) è mostrato come linea nera. Una mappa funzionale per il ceppo di riferimento 053442 è mostrata sopra sulla base della mappa funzionale di E.coli mostrata in Fig. 2