Origin of the electrophoretic force on DNA in solid-state nanopores

A makromolekulák feszültség által vezérelt transzportja biológiai6,7 és mesterséges8,9,10,11,12 nanopórusokon keresztül ideális rendszert biztosít a transzlokációs folyamat fizikájának tanulmányozására13. Az elektroforetikus migráció a DNS nanopórusokon keresztüli transzlokációjának fő hajtóereje, amely a külsőleg alkalmazott elektromos tér által a polielektrolitlánc töltéseire kifejtett erő következménye. Mivel az oldatban lévő DNS negatív töltésű, egy többé-kevésbé mozgékony, pozitív töltésű ellenionokból álló réteg árnyékolja, amelyet szintén érint az elektromos tér. Már régóta ismert, hogy az ellenionokra ható erő hidrodinamikai ellenállási erőt fejt ki a DNS-re, amely lokálisan kiegyenlíti az elektromos erőt, és sokkal lassabb vándorláshoz vezet, mint ami csak a Stokes-féle ellenállás alapján várható lenne (lásd például 1. hivatkozás). Egy polimer elektroforetikus transzlokációja egy kis póruson keresztül hasonló elveknek engedelmeskedik, de itt a pórus geometriája (vagy a gél helyi szerkezete) várhatóan alapvetően befolyásolja a DNS körüli hidrodinamikai áramlási profilt, és ezáltal a mozgással szemben álló ellenállási erőt1,5,14 . Az egyre kifinomultabb kísérletek ellenére3,12,15,16 a hidrodinamikai kölcsönhatások egyértelmű megnyilvánulásáról a DNS-transzlokációban még nem számoltak be. Itt ezt a kérdést a nemrégiben kifejlesztett, szilárdtest nanopórusokat optikai csipesszel3 kombináló készülékünkkel oldjuk meg a DNS-transzlokáció megállítására, és ezt követően megmérjük az egyetlen DNS-szálon fellépő megtorpanó erőt (lásd a Módszerek fejezetet). A mérőkészülék sematikus ábrája az 1a. ábrán látható.

a, A mérőkészülék sematikus ábrája. Optikai csipesszel a DNS-transzlokációt megakasztjuk, és mérjük a DNS-re ható erőt. Ezzel egyidejűleg a nanopórus ionos vezetőképességét is mérjük. b, A DNS hengeres modellje a nanopórusban. A DNS két oldalán lévő kék nyilak sematikusan ábrázolják a mozgó folyadék elektroozmózis miatti sebességét.

A gélelektroforézis-kísérlettel ellentétben a nanopórus-kísérletben az elektromos tér a pórus közvetlen környezetére korlátozódik, és az elektromos erők lokálisan hatnak a DNS egy rövid szakaszára. Az elektromos térerősség a pórusban a nagyon vékony (∼60 nm) szabadon álló membránok miatt jellemzően eléri a ∼106 V m-1 értéket. A λ-DNS nagy, kb. 50 nm-es perzisztenciahossza biztosítja, hogy a póruson belüli DNS-szegmens gyakorlatilag teljesen kiterjedt legyen. A helyzetet vázlatosan az 1b. ábra mutatja be, ahol L és R a pórus hosszát és sugarát, ΔV pedig az alkalmazott potenciált jelöli. A DNS-nek λbare=-0,96 nC m-1 (2 elektron bázispáronként) csupasz vonali töltéssűrűsége van, és itt egy a=1,1 nm sugarú, egyenletesen töltött hengerként modellezzük. A DNS gerincre ható csupasz elektrosztatikus erő a Fbare=λbareΔV (3. hivatkozás). Ezzel szemben áll az ellenionok ellentétes irányú elektroforetikus mozgása által okozott Fdrag húzóerő: Az Fdrag tehát a transzlokációs folyamat sajátos összetevője, amely végső soron szintén az elektromos erőkre vezethető vissza5. Az így kapott nettó erő a transzlokációt mozgató elektroforetikus erő, amelyet Felec=Fbare-Fdrag ad meg. Esetünkben a Felec-et az optikai csipeszekből származó Fmech=-Felec ellentétes mechanikai erő ellensúlyozza, amely a DNS-t a póruson belül rögzíti.

A Fdrag eredete az ionok térbeli eloszlásában és a megfelelő folyadékáramlási profilban rejlik. Az ioneloszlások átlagos mezőjű leírását a Poisson-Boltzmann formalizmus adja, amelyben az elektrosztatikus potenciál , a megfelelő ioneloszlások pedig . Itt λD a Debye-hossz, a redukált elektrosztatikus potenciál, e az elemi töltés, Φ a potenciál, kB a Boltzmann-állandó, T a hőmérséklet, n az ionok számsűrűsége és z az ionfaj valenciája. A 2a. ábra két pórusméretre számított potenciálokat mutat, amelyeket a Poisson-Boltzmann-egyenlet numerikus kiértékelésével kaptunk hengeres geometriában (lásd a Módszerek fejezetet). A megfelelő ioneloszlásokat a 2b. ábra mutatja. A DNS Debye-rétegét a koionok kimerülése jellemzi, míg az ellenionok a DNS nagy töltése miatt igen nagy sűrűségűre halmozódnak fel. Mivel ezek az eloszlások a teljes (nemlinearizált) Poisson-Boltzmann-egyenlet megoldásai, a Manning-kondenzáció17 hatása is szerepel.

a, Egy “nagy” pórus (zöld, R=10 nm) és egy “kis” pórus (kék, R=3 nm) redukált elektrosztatikus potenciálja. A szürke vonal jelzi a pórusfal helyét a kis pórus esetében. A sókoncentráció cbulk=20 mM (λD=2,2 nm), és a pórusfalakat az egyszerűség kedvéért töltésmentesnek tekintjük ebben a számításban. b, A megfelelő ioneloszlások. A “nagy” pórusokban (R≫λD) az ionok eloszlását a DNS körül nem befolyásolja jelentősen a pórusfal, amit az a megfigyelés jelez, hogy a zöld görbék elérik a tömegértéket. A “kis” pórusokban (R≲λD) azonban az ellenionfelhőt (folytonos görbék) a pórusfal összenyomja, és a pórus kimerülhet az ionokból (szaggatott görbék), így főként pozitív ellenionok maradnak a DNS negatív töltéseinek ellensúlyozására. Ezt a helyzetet példázzák a kék görbék. c, Az a és b eredményeknek a Stokes-egyenlettel való kombinálásával számított folyadéksebesség-profilok. d, A nyírófeszültség normalizált felületi integrálja minden egyes r pozícióban, módon kiszámítva, ahol τ a folyadékban lévő nyírófeszültség. A DNS felületén . e, A DNS (piros) és a nanopórus falára (szürke) számított redukált felületi potenciálok a pórus sugarának függvényében. A szürke terület minőségileg a “kis pórus” régiót ábrázolja, amelyben az ioneloszlásokat a nanopórus zártsága befolyásolja.

A DNS-akadásos kísérletünkben az ellenionok eloszlása nagyban meghatározza az indukált elektroozmotikus áramlás sebességprofilját. Az áramlási sebességprofil kiszámítható a Stokes-egyenlet megoldásával, ahol η a folyadék dinamikus viszkozitása, vz a folyadék sebessége, Ez az alkalmazott elektromos tér és ρ(r) az iontöltés-eloszlás. A számított folyadékáramlási profilokat a 2c. ábra mutatja. Ezt követően, hogy az áramlási profilt a viszkózus ellenálláshoz kapcsoljuk, a folyadékban lévő nyírófeszültséget a következőképpen számítjuk ki: τ(r)=-η(dvz/dr). A 2d. ábrán látható, amely a DNS felületén (r=a) értékelve egyenlő az Fdrag/Fbare aránnyal. Ez azt mutatja, hogy az Fdrag ugyanolyan nagyságrendű, mint a DNS-re ható csupasz elektrosztatikus erő, amellyel szemben áll. Fdrag nagyobb a nagyobb pórus esetén, ami kisebb megtorpanó erőnek felel meg.

A kísérleteinkkel való összehasonlításhoz célszerű a fenti modellt olyan formában kifejezni, amely az elektroforetikus erőt közvetlenül a nanopórus tulajdonságaival hozza összefüggésbe. Amint azt korábban kimutattuk5 , a Poisson-Boltzmann- és a Stokes-egyenletet kombinálva megkaphatjuk az álló molekulára ható elektroforetikus erő kifejezését,

Φ(a) és Φ(R) a DNS, illetve a nanopórus felületi potenciáljai, ε pedig a víz dielektromos állandója. és a Poisson-Boltzmann-egyenletből levezetett értékeket a 2e. ábrán ábrázoljuk R függvényében. Nagy pórusokban a felületi potenciálok függetlenek R-től. Az (1) egyenlet ezután azt jósolja, hogy a mért Fmech erő egyszerű ln-1(R/a) függést mutat a pórus méretétől. Kisebb pórusokban viszont a Debye-réteget a pórusfal összenyomja (2. ábra). Ez a felületi potenciálok pórusmérettől való függését és ennek megfelelően az Fmech R-től való bonyolultabb függését eredményezi.

A fenti modell közvetlen tesztelésének módja az Fmech DNS-elakadási erő mérése a pórus R sugarának függvényében. Mivel azonban a korábbi munkák kisebb pórusokra összpontosítottak, először azt mutatjuk be, hogy nagyon nagy (R≫a) nanopórusokban is lehetséges egyetlen DNS-molekula jelenlétének kimutatása. A pórusban lévő DNS kimutatása az ionos vezetőképesség ΔG lépésének mérésén alapul, amikor a DNS belép a pórusba. Korábban kimutatták, hogy a ΔG-t két tényező versengése okozza: a térfogatkizárás, amely csökkenti a vezetőképességhez rendelkezésre álló ionok számát, és a DNS-ellenionok feleslege, amely hatékonyan növeli a vezetőképességhez rendelkezésre álló ionok számát12. Az elektrolit térfogati koncentrációjától függ, hogy e két hatás közül melyik dominál, ami a jelen kísérletekben 20-50 mM sóval pozitív ΔG-t (a vezetőképesség növekedését) eredményezett. Ilyen optimalizált sókörülmények között a DNS-befogás jel-zaj aránya az előrejelzések szerint még a nagyon nagy pórusokban is magas lesz18. A 3a. ábrán egy tipikus áramlépés látható a gyöngy Z pozíciójának megfelelő változásával együtt. Egyértelmű lépést figyelhetünk meg az áramban, annak ellenére, hogy a DNS kevesebb mint 1%-kal változtatja meg a nanopórus vezetőképességét. A befogási események tipikus hisztogramja a 3b. ábrán látható. Ezek az adatok azt mutatják, hogy még az R=45 nm-es nanopórusokba is képesek vagyunk szabályozhatóan behelyezni és detektálni egyetlen molekulát, ahol a DNS a nanopórus keresztmetszeti területének csak 1/2000-ed részét fedi le.

a, Az I pórusáram (felső panel, piros átlag) és a Z gyöngy pozíciójának (alsó panel) tipikus példája a DNS befogása során egy R=39 nm-es pórusban 33 mM KCl-ban, 80 mV-on. Az áramméréseket 1 kHz-en aluláteresztő szűréssel szűrtük. b, A nanopórusban 88 DNS-befogás ΔG hisztogramja az a. ábrával megegyező körülmények között. c, ΔG különböző sugarú pórusokban. A befogási események jellemzően 60-100 mV-os feszültségeknél következtek be. A vízszintes szaggatott vonal szembeállításként szolgál. Háromszögek: 20 mM KCl, csillagok: 33 mM KCl, rombuszok: 50 mM KCl, zöld csillag: b-ből származó adatok, hibasávok: a ΔG-hisztogramokból kiértékelt szórás. A nyitott szimbólumok optikai csipeszek nélküli szabad transzlokációs kísérletekből származó adatokat jelölnek.

A 3c. ábrán a kísérletileg meghatározott ΔG értékek a nanopórus sugarának függvényében láthatóak 10 nanopórusra, amelyek sugara R=3 és 45 nm között változik. A szürke terület jelöli a “kis pórus” régiót, amelyben a 2b. ábrán látható számítások szerint a DNS közelében az ioneloszlásokat a nanopórus falának jelenléte befolyásolja. A szimulációkkal látszólag egyezően a ΔG a nagy nanopórusokban megközelítőleg állandó. A kis nanopórusokban a nagyobb ΔG összhangban van a diffúz szűrőréteg összenyomásával, ami biztosítja a töltéssemlegességet a pórusban. A mért ΔG és az elmélet kvantitatívabb összehasonlítása azonban nehéz: a Racc hozzáférési ellenállás a nagy pórusokban egyre nagyobb mértékben járul hozzá a rendszer teljes ellenállásához19 , és jelenleg nem ismert, hogy a póruson átfűződő DNS jelenléte hogyan befolyásolja a Racc-ot.

Miután megállapítottuk a DNS-molekulák nagy és kis pórusokban való megállításának és kimutatásának megvalósíthatóságát, most rátérünk e levél fő eredményére, nevezetesen az Fmech megállító erő kísérletileg meghatározott nagyságára a nanopórus R sugarának függvényében. A 4a. ábra az Fmech-et mutatja az alkalmazott ΔV feszültség függvényében R=4 nm-es (bal oldali panel) és R=39 nm-es (jobb oldali panel) nanopórusokban. Ez az összefüggés mindkét esetben megközelítőleg lineáris. Az Fmech/ΔV azonban a kis pórusban kétszer nagyobb, mint a nagy pórusban. A 4b. ábra az Fmech/ΔV arányt mutatja a pórusméret függvényében: Az Fmech/ΔV a pórusméret növekedésével fokozatosan csökken, ahogy az (1) egyenlet alapján várható volt. A szaggatott görbe a teljes DNS-töltésre vonatkozó felületi potenciálok (2e. ábra) és az (1. egyenlet kombinálásából adódik, minden további kiigazítás nélkül. Az egydimenziós modellben rejlő egyszerűsítések ellenére az elméleti eredmény elég jól megragadja az adatok tendenciáját, bár mennyiségileg ∼50%-kal túlbecsüli az elakadási erőt. Ez a különbség több tényezőnek (ezek kombinációjának) tulajdonítható, beleértve az ellenionok mobilitásának csökkenését a DNS felületén12,20, vagy a nanopórus felületén lévő rögzített töltésekből eredő extra ellentétes elektroozmotikus folyadékáramlást5. Az (1) egyenlet szempontjából mindkét hatás a felületi potenciálkülönbség ΔΦ=Φ(a)-Φ(R) nagyságának csökkentésével, ezáltal az Fmech nagyságának csökkentésével ábrázolható. A ΔΦ 33%-os csökkentése empirikusan a 4b. ábrán látható folytonos görbét eredményezi, amely kiválóan illeszkedik a kísérleti adatokhoz. A ΔΦ ilyen mértékű csökkentése egyenértékű azzal, hogy a DNS csupasz töltésének körülbelül 50%-át a felületén hatékonyan immobilizált ionok szűrik ki (amint azt az S1. kiegészítő ábra mutatja), vagy azzal, hogy a pórusfalon 15 mC m-2 felületi töltés van jelen (S2. kiegészítő ábra). Bár a kísérletünk nem tud közvetlenül különbséget tenni e két mechanizmus között, a következtetett felületi töltéssűrűség jellemző a SiO2 felületekre21. Ez arra utal, hogy a nanopórusaink felületi töltéssűrűségét nem befolyásolja erősen a gyártási folyamat, és hogy a pórustöltés felelős a megfigyelt korrekció jelentős részéért.

a, Az elakadási erő mérései az alkalmazott potenciál függvényében egy kis (bal oldali panel) és egy nagy nanopórusban (jobb oldali panel). Minden esetben két, a gyöngy és a nanopórus közötti különböző távolságoknál kapott mérés látható. b, A mért erő a pórus sugarának függvényében. A kék és zöld szimbólumok megfelelnek az a. pontban szereplő adatoknak. A kis pórusra vonatkozó adatokat a ref. 3. A görbék az elméleti eredményt mutatják csupasz DNS-töltésre (szaggatott görbe) és csökkentett ΔΦ-re (folytonos vonal, lásd a szöveget). A betoldás sematikusan mutatja, hogy a DNS-ellenionokra ható erő hogyan oszlik meg a DNS és a pórusfalak között a viszkózus ellenállás révén egy kis és egy nagy pórusban; a sárga nyíl a DNS-re ható csupasz elektrosztatikus erőt jelöli. Háromszögek: 20 mM KCl, csillagok: 33 mM KCl, rombuszok: 50 mM KCl. A hibasávok az optikai csapda kalibrálásának bizonytalanságaiból adódnak, amelyeket a kalibrált csapda merevségének 10-30%-ára becsülünk.

Az egyszerű modellünkben figyelembe nem vett külső tényezők is befolyásolhatják az elakadási erő abszolút értékét. Például a gyöngyre vagy a DNS-nek a nanopóruson kívüli elektromos mezőben lévő részére ható elektrosztatikus és/vagy hidrodinamikai erők előfeszíthetik. Kísérleteink azonban nem mutatnak bizonyítékot ilyen hatásokra, mivel nem észleltünk változást az elakadási erőben, amikor a gyöngyöt a nanopórustól egyre távolabb helyeztük el3. Ezenkívül a kísérleti erő-feszültség görbék lineárisak a feszültségtartományunkban (4a. ábra), ami azt jelzi, hogy az entrópikus erők kicsik az elektrosztatikus erőkhöz képest, ami összhangban van a DNS nyújtása során fellépő entrópikus erők független méréseivel22.

A mért erő függése a pórus sugarától a 4b. ábrán közvetlenül bizonyítja, hogy a DNS-transzlokációban az elektroforetikus erőt részben a DNS ellenionjai és a nanopórus fala közötti hidrodinamikai csatolás határozza meg. A nanopórus geometriája határozza meg az ellenionok által a DNS-re kifejtett húzóerő nagyságát. Ennek a csatolásnak fontos következményei vannak a kísérletileg meghatározott erők értelmezésére, mivel ezeket az erőket nyilvánvalóan nem csak a DNS belső tulajdonságai határozzák meg1,23.

Az erő változása is várható a sókoncentráció növekedésével, mivel ez megváltoztatja a Debye-hosszúságot és ezáltal mind a DNS felületi potenciálját, mind pedig feltehetően az Fmech elakadási erőt. Ezt a várakozást azonban megnehezítik azok a tények, hogy a pórusok felületi töltéssűrűsége is jelentősen változik a sókoncentrációval12 , és hogy az itt használt átlagmező-elmélet nagy ionerősségnél megbízhatatlanná válik. Korábbi kísérletekben az Fmech valójában 1 M-ig független a sókoncentrációtól (hivatkozás 3), és ezeknek az adatoknak egy olyan modellen alapuló értelmezését, amelyben Φ(R) a sókoncentrációtól függ, Ghosal5 javasolta.

A szabad DNS-transzlokációban az Fmech visszaállító erő hiányzik, és gyakorlatilag a molekula sebességével arányos FStokes extra Stokes-ellenállással helyettesíthető. A molekula állandó sebességgel transzlokálódik, az elektroforetikus erőt az FStokes ellensúlyozza. Az optikai csipesszel mért Fmech elakadó erő és a szabad DNS-transzlokációs kísérletekből meghatározott vtrans transzlokációs sebesség közötti összefüggés a következő4,5,14

Ez az eredmény egyenértékű azzal a Stokes-ellenállással, amelyet egy hengeres póruson keresztül állandó vtrans sebességgel transzlokálódó töltetlen henger tapasztalna. Így Fmech és vtrans arányos mennyiségek, amelyek egy geometriafüggő tényezővel függenek össze. Ezt a várakozást minőségileg megerősítik a kísérleti adatok3,12 , amelyek azt mutatják, hogy az Fmech és a vtrans valóban nagyjából arányosak. A vtrans kiszámítása a λ-DNS kontúrhosszának és a kísérletileg meghatározott transzlokációs idő hányadosaként vtrans=(16 μm/1,1 ms)≈15 mm s-1, ami Fmech/vtrans=1 750 pN s m-1 (5 nm sugarú pórusokra vonatkozó adatok). A (2) egyenlet azonban 249 pN s m-1 értéket ad erre a tényezőre, ha η=1×10-3 N s m-2, L=60 nm, R=5 nm és a=1,1 nm. Ez hétszer alacsonyabb, mint a kísérletileg kapott érték. A DNS transzlokációja ezeken a pórusokon keresztül tehát sokkal kisebb sebességgel történik, mint az optikai csipesszel mért elektroforetikus erők és az átlagos mező leírása alapján várható. Mivel minden kísérletben hasonló nanopórusokat használtunk, ez a következtetés egy alapvető különbségre utal a megrekedt molekula statikus helyzete és a transzlokálódó molekula dinamikus helyzete között. A szabad DNS-transzlokációban a DNS póruson kívüli konformációja extra ellenállást eredményez a mozgó molekulára24 , ami magyarázatot adhat az eltérésre.

Végeredményben megmutattuk, hogy a nanopórusban lévő DNS-molekulára ható elektroforetikus erő függ a pórus geometriájától. Ez nem várható az egyszerű elektrosztatikából, de egyenesen megérthető, ha figyelembe vesszük az oldatban a DNS-t szűrő ellenionok által kiváltott hidrodinamikai ellenállást. Az átlagmező-egyenleteken alapuló numerikus számítások jól leírják a mért erők pórusméret-függését.