Neutrofil diapedézis:

A gyulladás egyik klasszikus jellemzője az érintett szövetek polimorfonukleáris leukociták (PMN) általi infiltrációja. Ehhez a keringő PMN-eknek olyan adhéziós kölcsönhatásokon kell keresztülmenniük az endotéllel, amelyek lehetővé teszik számukra, hogy aktiválódjanak, lelapuljanak és kivándoroljanak a mikrovesszek endotélbélésén keresztül. Ezeknek az adhéziós kölcsönhatásoknak a molekuláris meghatározóit széles körben tanulmányozták, és általános konszenzus van az események azon sorrendjét illetően, amely ahhoz vezet, hogy a PMN olyan helyzetbe kerül, hogy a szövetekbe emigráljon (3, 12). Kezdetben gyenge adhéziós kölcsönhatás jön létre a keringő PMN és az endothelium között, ami a PMN-nek az endothelium mentén történő saltatorikus mozgását eredményezi, ezt a jelenséget nevezzük gördülésnek. A gördülés lehetővé teszi, hogy a PMN szorosan az endotélhez tapadjon, és ha lokálisan keletkező gyulladásos mediátorok vannak jelen, a PMN aktiválódik. Miután aktiválódtak, a PMN-ek erősebb adhéziós kölcsönhatásokat alakítanak ki az endotéllel, ami a megállásukhoz vezet. Ezt követően a PMN emigrál az endotélen keresztül. A kezdeti adhéziós kölcsönhatásoktól (gördülés és adhézió) eltérően, amelyekkel kapcsolatban általános konszenzus van a mechanizmusokat illetően, a PMN transzendotheliális migrációjában szerepet játszó mechanizmusokról keveset tudunk. Még az az alapfeltevés is ellentmondásos, hogy a PMN-ek az endotélsejtek között (paracelluláris útvonal) vagy magán az endotélsejteken keresztül (transzcelluláris útvonal) vándorolnak-e.

Az uralkodó konszenzus szerint a keringő PMN-ek az intravaszkuláris kompartmentből az interstitiumba a szomszédos endotélsejtek között, azaz paracelluláris úton vándorolnak (11). Mind az in vivo, mind az in vitro vizsgálatok elektron- és fénymikroszkópiával rögzítették a vándorló PMN-eket, amint a kemotaktikus gradiensre reagálva pszeudopodiákat nyúlnak ki az endotélsejtek közé, hogy áthaladjanak az endoteliális gáton. Ahhoz, hogy a PMN képes legyen a paracelluláris útvonalat használni a transzendotheliális migrációhoz, a szomszédos endothelsejtek közötti adhéziós kapcsolatot meg kell bontani, és az endothelsejteknek eléggé el kell válniuk egymástól ahhoz, hogy a PMN áthaladhasson. Számos, a gyulladás in vitro szimulálására használt gyulladásos mediátor önmagában is képes rések kialakulását, azaz az endotélsejtek visszahúzódását kiváltani a tenyésztett endotélsejt-monolayerekben. Mivel azonban az endotélsejtek közötti nagy rések ritkán figyelhetők meg a gyulladás in vivo modelljeiben, ez a jelenség a gyulladásos mediátorok eltúlzott hatását jelentheti az in vitro rendszerekben. A tenyésztett endotél monolayerek interendothelialis adhéziós csomópontjai fejletlenebbek, mint in vivo társaiké, és így a gyulladásos mediátorok in vitro könnyebben okozhatnak endothelsejt-visszahúzódást, mint in vivo (12). E jelenség in vivo korrelátuma a gyulladásos mediátorok hatására megfigyelhető fokozott makromolekuláris szivárgás az interendothelialis kapcsolódási pontokon keresztül. Az in vitro vizsgálatok együttesen alátámasztják azt az elképzelést, hogy az endotélsejtek gyulladásos mediátorok hatására elválhatnak egymástól, bár az elválás mértéke eltúlzott lehet.

A bizonyíték arra, hogy a PMN endotélsejtek visszahúzódását idézheti elő, elsősorban olyan in vitro vizsgálatokból származik, amelyek a PMN által közvetített endotélsejt-károsodásban szerepet játszó mechanizmusokkal foglalkoztak (12). Ez a sérülés nem liptikus jellegű volt, és endotélsejtek leválásában nyilvánult meg a nem porózus felületeken növesztett monolayerekről. Az endotélsejtek leválása 3-6 órával az aktivált PMN-ek endotélsejt-monorétegek felszínére történő rétegződését követően következett be, és a PMN-ek által termelt elasztáznak tulajdonították. Mivel a gyulladás in vivo modelljeiben ritkán figyelhető meg endotélsejtek leválása, úgy tűnik, hogy a PMN által közvetített endotélsejt leválás szintén egy in vivo esemény eltúlzása, ami az in vitro előírt kísérleti körülményeknek köszönhető. Ezekben a rendszerekben (nem porózus felületeken növesztett endotél monorétegek) a PMN-ek nem transzmigrálhatnak és nem távolodhatnak el az endotélsejt monorétegtől. Így az endotélsejtek közvetlen közelében maradnak, és a monoréteg proteolitikus súlyosbodásában megmaradnak, ami végül az endotélsejtek visszahúzódását, majd leválását idézi elő. Ha hagyjuk, hogy az aktivált PMN-ek átvándoroljanak az endotélsejt-monorétegen, ritkán figyelhető meg durva endotélsejt-retrakció és leválás.

A PMN-ekből származó elasztáz képes endotélsejt-retrakciót és leválást indukálni a monorétegen belül. Ez analóg a proteázok endotélsejtek expanziójára történő alkalmazásával, azaz a proteázzal kezelt sejtek visszahúzódnak és leválnak a szubsztrátumról, de proteázgátlóval történő kezelés után újra beültethetők és normálisan tovább növekednek. Érdekes módon mind az endotélsejtek visszahúzódása, mind a PMN transzendoteliális migrációja megakadályozható proteáz (pl. elasztáz) inhibitorokkal. Ez utóbbi megfigyelések arra utalnak, hogy a PMN-ek az endogén elasztázt használják az endotélsejtek olyan mértékű visszahúzódásának kiváltására, amely elegendő ahhoz, hogy a szomszédos endotélsejtek között áthaladhassanak anélkül, hogy károsítanák azokat. A legújabb vizsgálatok arra utalnak, hogy az elasztáz által közvetített PMN transzendotheliális migráció egy erősen szabályozott folyamat, amely nem igényel PMN degranulációt (3). Az aktivált PMN-ek nem szekretálnak elasztázt az extracelluláris miliőbe, hanem az elasztázt a membránra mobilizálják és a migrációs frontra, pl. a szomszédos endotélsejtek közé behatoló pszeudopodiákra lokalizálják. Azt, hogy a PMN-ek degranulációja nem szükséges a transzendoteliális migrációjukhoz, az a megfigyelés is alátámasztja, hogy a PMN-citoplasztok (granulumoktól mentes anukleáris PMN-ek) kemotaktikus gradiensre reagálva ugyanolyan hatékonyan vándorolnak át az endoteliális monorétegen, mint a normál PMN-ek. A citoplasztok transzendotheliális migrációja ismét megakadályozható elasztáz inhibitorokkal.

Az endothelsejteket transzmembrán fehérjékből álló adhéziós csomópontok tartják össze (11). Így ahhoz, hogy a neutrofilek az endotélsejtek között áthaladhassanak, meg kell szakítani ezen kapcsolódási pontok adhéziós kölcsönhatásait. A PMN transzendotheliális migrációja szempontjából kétféle adhéziós csomópont létezik: az adhéziós csomópontok és a szoros csomópontok. Az adherens csomópontok vaszkuláris-endotél (VE)-kadherin/katenin komplexekből állnak. A VE-kadherinnek van egy extracelluláris doménje, amely homotipikusan kölcsönhatásba lép a szomszédos endotélsejteken lévő VE-kadherinnel. A VE-kadherin citoplazmatikus doménje intracelluláris β- vagy γ-kateninekkel társul. Ezek a VE-kadherin/katenin komplexek az α-katenin révén kapcsolódnak az aktin citoszkeletonhoz (1A ábra). A szoros kötések több transzmembrán fehérjéből állnak, beleértve az okkludint és a claudin 1 és 2-t, valamint a hozzájuk kapcsolódó intracelluláris fehérjékből, mint például a ZO-1, -2 és -3, amelyek a szoros kötés fehérjéit a citoszkeletonhoz kötik. E két adhéziós csomópont közül a PMN transzendotheliális migrációjának az adhéziós csomópontokra gyakorolt hatása kapta a legnagyobb figyelmet.

Konfokális mikroszkópiával végzett újabb vizsgálatok szerint a PMN adhéziós kölcsönhatások (adhézió és transzendotheliális migráció) az adherens junction fehérjék helyi megszakadását eredményezhetik (10). A PMN-ek két populációját örökítettük meg endotélsejt-monolayerekhez tapadva: 1) azokat, amelyek alatt nem volt az adherens junction fehérjék folytonosságának megszakadása, és 2) azokat, amelyek alatt az adherens junction fehérjék megszakadása volt. Az adherens csomópontok folytonosságának megszakadása a tapadó PMN által helyi jelenség volt, mivel a PMN-től távolabb lévő adherens csomópontokat nem érintette. A szisztematikus elemzés kimutatta, hogy a tapadó PMN alatti adherens junction fehérjéket szekvenciálisan érintették, azaz a β-katenin előbb veszett el, mint a VE-kadherin. A transzendotheliális migráció során befogott PMN-ek változatlanul az összes adherens junction fehérje elvesztésével jártak a migráció helyén. A migráló PMN-től távolabb eső helyeken ismét nem volt hatás az adherens csomópontok integritására. Továbbá, az adherens csomópontok megszakadásának fontosságát a PMN transzendotheliális migrációjában a következők bizonyítják: 1) in vivo a VE-kadherin elleni antitestek fokozták a PMN emigrációt, és 2) in vitro a VE-kadherin elleni antitestek fokozták a PMN transzendoteliális migrációját, és az endoteliális aktin citoszkeleton átrendeződését idézték elő, ami az endotélsejtek közötti rések kialakulásához vezetett.

A szoros kötéskomplexek tekintetében a legújabb vizsgálatok hasonló megfigyeléseket tettek. A PMN transzendotheliális migrációja csak a PMN-nek az interendothelialis csomópontokba való behatolásának helyén zavarta meg a ZO-1 és -2 folytonosságát (1). A szoros kötések széleskörű megszakadásait nem észlelték.

A paracelluláris diapedézisben szerepet játszó lehetséges mechanizmusok

A mechanizmus, amellyel a PMN-endothelsejtek adhéziós kölcsönhatásai megszakítják az adherens junction-t, nem világos. Az egyik lehetőség, hogy a tapadó PMN endogén proteázokat használ az adherens junction fehérjék lebontására (1A ábra). Az elasztáz inhibitorok például képesek voltak csökkenteni a VE-kadherin és a β-katenin adherens csomóponti fehérjék PMN-indukálta elvesztésének mértékét (2). Más vizsgálatok (11) azt mutatják, hogy az aktivált PMN képes lebontani a VE-kadherint, és hogy az elasztáz inhibitor képes megakadályozni ezt a lebontást. Továbbá, a tisztított neutrofil elasztáz a VE-kadherin degradációs termékeit hasonlóan termeli, mint amilyeneket ennek az adherens junction komponensnek az aktivált PMN általi degradációja után észleltek. Együttesen valószínűnek tűnik, hogy a PMN-eredetű elasztáz szerepet játszik az adherens junction felbomlásában.

A PMN-endothelsejt adhéziós kölcsönhatások azt is jelezhetik az endothelsejteknek, hogy aktívan részt vesznek a PMN transzendotheliális migrációjában azáltal, hogy elválnak egymástól, azaz interendotheliális rés kialakul (1A ábra). Ezt az állítást a következő bizonyítékok támasztják alá. Az adherens PMN-ek képesek az endotélsejtek Ca2+-szintjének növekedését előidézni, és ennek a Ca2+-nak a kelátképzése a PMN transzendoteliális migráció gátlását eredményezi. Továbbá, az endoteliális miozin könnyűlánc-kináz (az endotélsejtek közötti rés kialakulásának kulcsfontosságú meghatározója) gátlása csökkentette a PMN transzendoteliális migrációját (11). Végül, amint arra fentebb rámutattunk, a tapadó PMN-ek az intracelluláris β-katenint a plazmamembránon átívelő VE-kadherin előtt befolyásolják. Ezek a megfigyelések együttesen arra utalnak, hogy az endotélsejtek egymásról való visszahúzódással aktív részvételre késztethetők a PMN transzendoteliális migrációjában.

A transzcelluláris diapedézis mellett szóló bizonyítékok

Más korai és újabb, a leukocita-diapedézist in vivo ultraszerkezeti megközelítéssel vizsgáló jelentések azt jelzik, hogy a PMN-ek többsége transzcellulárisan lép ki az érrendszerből, ill, az endotél citoplazmáján áthaladó pórusokon vagy átjárókon keresztül. A sorozatmetszetek transzmissziós elektronmikroszkópiával történő vizsgálata arra utal, hogy a PMN-ek olyan régiókon keresztül is vándorolhatnak, amelyek nem kapcsolódnak azonosítható sejt-sejt-összeköttetésekhez (4, 5, 8). Azzal érveltek, hogy még a sorozatmetszés sem szolgáltat egyértelmű bizonyítékot arra, hogy egy sejt-sejt-összeköttetés nem volt a közelben, hanem inkább arra, hogy esetleg nem vették észre. Ezenkívül nehéz lehet az elektronsűrű adherens csomópontok azonosítása, különösen azokban a régiókban, ahol az endothel <0,5 μm magas. Végül, a legújabb in vitro adatok arra utalnak, hogy a sejt-sejt adherens junctions molekulárisan szétesnek a PMN diapedézis során (10), és ezért morfológiailag nem várható, hogy látni fogjuk őket.

A pásztázó elektronmikroszkópos képek meggyőzőbb bizonyítékot szolgáltatnak arra, hogy a PMN-ek olyan nyílásokon keresztül hatolnak be az endothelsejtekbe, amelyek nem kapcsolódnak endothel sejt-sejt kontaktusokhoz (4, 9). A diapedézis folyamatában lévő PMN-ek súlyzó alakúnak tűnnek, az endotél szintjén lévő régióban szűkülettel (4, 5, 7, 8, 9, 13, 15). Attól függően, hogy a diapedézis mennyire előrehaladott, egy buborékszerű nyúlvány látható, amely vagy az érlumenbe nyúlik, vagy az interstitiumba nyúlik (5, 9, 11, 15). Ez azt jelzi, hogy a leukociták inkább egy kis, korlátozott átmérőjű körkörös póruson préselődnek át, mintsem az egyes endotélsejtek egymástól való visszahúzódását idéznék elő. Az endotélsejt és a leukocita a diapedézis során szoros kapcsolatban marad. Az endotél gyakran úgy tűnik, hogy a PMN felszínének luminális oldala mentén szétterül, hogy teljesen elnyelje azt, ezáltal lezárva a luminális rést, mielőtt a PMN a szöveti mátrixba kerülne (4, 5, 8). Ezt a folyamatot gyakran megfigyelték az in vivo emigráció során, de nem bizonyították, hogy a transzendotheliális migráció során in vitro is bekövetkezik.

A transzcelluláris diapedézisben részt vevő lehetséges mechanizmusok

Noha in vivo vizsgálatokban nehéz szigorú mechanisztikus megközelítéseket alkalmazni, elegendő közvetett bizonyíték áll rendelkezésre több lehetséges mechanizmus alátámasztására, amelyek révén a PMN-ek transzcellulárisan emigrálnak. Elképzelhető, hogy a transzcelluláris pórusok, amelyeken keresztül a PMN-ek vándorolnak, az endothelium proteolitikus károsodásának következményei. Rámutattak azonban arra, hogy – legalábbis ultrastrukturálisan – az endothelium sértetlen marad, és továbbra is barlangocskákat és endocitotikus vezikulákat képez még a PMN-ekkel szoros kapcsolatban lévő membránterületeken is (13). Valószínűbb, hogy a PMN-ek, amelyek a jelek szerint rövid távolságokat vándorolnak az apikális endotélfelszín mentén, az endotél vékony régióit, például a fenesztrákat keresik fel. A fenesztrák lehetnek nyitott (50 nm átmérőjűek) vagy két plazmamembrán vastagságú (citoplazma nélküli) membránnal körülvett területek. Így a PMN könnyedén áthaladhat a nyitott fenesztrákon, vagy proteolitikusan áthaladhat a diafragmás fenesztrákon anélkül, hogy károsítaná a tulajdonképpeni endothelt. A fenesztrák a PMN emigráció fontos útvonalát jelenthetik azokban a szervekben, amelyek fenesztrált mikrovesszőket tartalmaznak (pl. gyomor-bél nyálkahártya, váladékozó mirigyek).

A folyamatos mikrovesszőket tartalmazó szervekben (pl. bőr, izom) a PMN használhat caveolákat vagy pinocitotikus vezikulákat, és ezekbe filopodiákat illeszthet be, hogy áthatoljon az endoteliális gáton. Ezek az 50 és 100 nm közötti átmérőjű struktúrák feltehetően közvetítik a fehérjetranszportot az endotélen keresztül, és extrajellegű útvonalat biztosítanak a vaszkuláris fehérjeszivárgás számára a gyulladás során. Nemrégiben kimutatták, hogy a caveolák vesiculo-vacuoláris organellumokat alkotnak, amelyek kis, folyamatos membránhoz kötött átjárókat képezhetnek az endotélsejt citoplazmáján keresztül (6). Kimutatták, hogy az ilyen caveolák és vezikulák képződése folytatódik az endotél felszíni membránjának olyan régióiban, amelyek érintkeznek a megtapadó PMN-ekkel (13). Ezenkívül az endotélsejt felszínéhez szorosan tapadó PMN-ek gyakran ujjszerű filopodiákat nyúlnak az apikális plazmamembrán bemélyedéseibe, ezáltal átformálva az endotélfelszínt (4, 7, 8). A tapadó filopódiumnak a formálódó vesiculo-vacuoláris organellumokba való benyúlási ereje ahhoz vezethet, hogy ez a filopódium az abluminális endotéloldalon is megjelenik (1B. ábra), ahol könnyen kölcsönhatásba léphet az extracelluláris mátrixszal és annak mentén szétterjedhet (1B. ábra).

A PMN vezető pszeudopodiáiban lévő F-aktin és mikrofilamentumok koncentrációját mutatták ki a diapedézis során in vivo (15) és in vitro (3), és ez generálhatja az előrehaladó sejtfolyamatok transzcelluláris pórusokon keresztül történő húzásához szükséges erőt. A pórusok 3-5 μm-es méretre tágulhatnak, amelyen a leukocita könnyen áthaladhat. A kezdeti vakuoláris pórusnak ezt a kitágulását részben a leukocita gömb alakú, még az ér lumenébe benyúló részében jelen lévő kérgi mikrofilamentumrendszerben keletkező feszültség által keltett erők érhetik el. Valójában a diapedézis késői szakaszában megfigyelték az F-aktin koncentrációját a transzmigráló PMN-ek caudális régiójában (15). Ezenkívül az endotél citoszkeletális citoplazmájában történő citoszkeletális átrendeződés segítheti a transzendoteliális pórus kiszélesedését, ahogyan azt korábban már javasolták (14). A pórusképződés folyamatát az apikális endotélmembrán-régiók szétterülése kísérné a PMN-sejtek felszíne mentén, ami a luminális PMN-részeknek az endotél általi végső elnyeléséhez vezetne, amint azt az elektronmikroszkópos felvételeken kimutatták (1B. ábra). Az endotélnek ez az aktív részvétele elősegítené az endotélbélés gyors újrazáródását, ezáltal korlátozva a fehérjeszivárgást.

Összefoglalás

A bizonyítékok eme áttekintéséből nyilvánvaló, hogy a PMN mind paracelluláris, mind transzcelluláris utakat használhat az endotélgáton való áthaladásra a gyulladás során. Érdemes rámutatni, hogy a PMN transzendotheliális migrációja in vitro a paracelluláris útvonalat, míg a PMN transzendotheliális migrációja in vivo a transzcelluláris útvonalat részesíti előnyben. Ha teleologikusan feltételezzük, hogy a transzmigráló PMN a legkisebb ellenállás útját választja, akkor magyarázatot kaphatunk az in vitro és in vivo megközelítésekkel kapott eredmények közötti látszólagos eltérésre.

A tenyésztett endotélsejt-monolayerekben a sejt-sejt-összeköttetések közelében vannak a leginkább gyengített régiók, és ezért nem meglepő, hogy ez a preferált hely, ahol a diapedézis bekövetkezik. Továbbá a tenyésztett endotélsejtekben a sejtek közötti csomópontok instabil struktúrák, amelyek folyamatosan szét- és újra összeállnak. Egy ilyen régiót a transzmigráló leukociták pszeudopodiái könnyen elérhetnek. Arra is van bizonyíték, hogy a PMN által a diapedézis során használt paracelluláris útvonal még in vitro is specifikusan szelektált, azaz a diapedézis inkább a tricelluláris sarkokban történik, mint két endotélsejt között (1). Az adherens junctions és a tight junctions ezeknél a tricelluláris sarkoknál nem folyamatosak, így a legkisebb ellenállás útját jelentik a transzmigráló PMN számára. Ezzel szemben az interendothelialis csomópontok in vivo sokkal jobban fejlettek, és ellenállóbbak a rajtuk keresztül történő fehérjemozgással szemben. Így a PMN előnyben részesítheti az endotélsejtek vékony régiójában lévő pórusokat, például a fenesztrákat vagy a caveolákat, mint a legkisebb ellenállás útját.

A PMN által a diapedézis során használt preferenciális útvonalat (paracelluláris vs. transzcelluláris) annak tulajdonítani, hogy in vitro vagy in vivo megközelítéseket használtak-e a jelenség vizsgálatához, különösen leegyszerűsítés. Számos példa van az ettől a paradigmától való eltérésre. Például vannak arra utaló bizonyítékok, hogy a PMN in vivo a paracelluláris útvonalat, in vitro pedig a transzcelluláris útvonalat használhatja. Továbbá, ha a transzcelluláris útvonal a preferenciális a PMN-diapedézishez in vivo, miért változtatja meg drámaian a junctional fehérjék zavarása a PMN-diapedézist in vivo? Könnyen lehet, hogy ez a vita még évekig fennmarad, hasonlóan ahhoz a vitához, hogy a transzendotheliális fehérjemozgás preferenciálisan a paracelluláris vagy a transzcelluláris útvonalon keresztül történik. Elképzelhető, hogy a PMN transzendotheliális migrációjának útvonalával kapcsolatos viták részben a gyulladásos válasz jellegének vagy annak az érágynak a jellegének tulajdoníthatók, amelyben a migráció történik. Remélhetőleg további vizsgálatok további információkkal szolgálnak majd, amelyek lehetővé teszik ennek a vitának a feloldását.