Articles / október 16, 2021

Megjavított dinamikus fényszórás a korrelációs adatok adaptív és statisztikailag vezérelt, időben felbontott kezelésével

Ebben a munkában egy új DLS mérési és adatkezelési eljárást írunk le és értékelünk, amely a detektorból érkező fotonérkezési időadatokat nagyon kis blokkokra vágja, amelyek mindegyikét külön almérésként korreláljuk. Az egyes korrelált részmérésekből származó számos mennyiség statisztikai eloszlását, amely a mérési folyamat során épül fel, felhasználjuk az átmeneti események osztályozására, mint például az 1b. ábrán látható 10 s-os részmérés végén, 8 s és 10 s között, és a fennmaradó állandósult állapotú adatoktól (0 s-tól <8 s-ig az 1c. ábrán) elkülönítve elemezzük őket. Az eredményt ezután külön-külön összeadjuk egy tranziens és egy állandósult állapotú korrelogrammpárként, amelyeket aztán redukálunk, hogy megkapjuk a tranziens és az állandósult állapotú részecskeméret-eloszlásokat. Lényeges, mivel az összes gyűjtött adat (tranziens és állandósult állapot) elemzése és jelentése megtörténik: egyetlen adat sem kerül elutasításra vagy elrejtésre a felhasználó elől, és minden mintaeredmény teljes és torzításmentes ábrázolása, akár polidiszperz, akár nem, de az erős tranziens szórók jelenlétében érdekes állandósult állapotú frakciók megnövekedett bizonytalanságai nélkül. Továbbá ez az eljárás eredendően foglalkozik azzal a határesettel, amikor olyan sok aggregátum van jelen, hogy a minta elsődleges frakciójának ezeket a nagyobb komponenseket kell tekinteni, azaz az aggregátumok olyan nagyszámúvá válnak, hogy jelük lesz az állandósult állapotú frakció27.

Azt is megállapítottuk, hogy a tranziens és állandósult állapotú osztályok osztályozása és elkülönített csökkentése nagyon rövid mérési részfolyamatok alapján és maguknak az adatoknak a statisztikáján alapuló módon az állandósult állapotú osztályon belüli változékonyság statisztikailag releváns minimalizálásához vezet a rövid teljes mérési idő alatt, ami közvetlenül az állandósult állapotú DLS-adatok pontosságának növekedéséhez vezet, miközben egy jól viselkedő minta esetében a teljes mérési időt egy nagyságrenddel csökkenti a jelenleg kereskedelmi forgalomban kapható műszerekhez képest.

A technika fejlesztését e szakasz további részében ismertetjük a polisztirol latex részecskék, mint ismert méretű modellrendszer és a lizozim diszperziók, mint törékeny, alacsony szórású minta méréseinek felhasználásával. A technika előnyeit bemutató számos esettanulmányt a 3. szakasz ismerteti, a következtetéseket a 4. szakasz vonja le, az alkalmazott módszereket pedig az 5. szakasz ismerteti.

Elemzési módszerek

Míg a technika ugyanúgy alkalmazható keresztkorrelált mérésekre, a legtöbb kereskedelmi forgalomban kapható műszer a detektált, szórt fotonok I(t) idősorának g2(|q|;τ) autokorrelációs függvényét méri, amelyet a következő adattal adunk meg,

$$${g}^{2}(|{\boldsymbol{q}}|;\tau )=\frac{\langle I(t)I(t+\tau )\rangle }{\langle I(t){\rangle }^{2}}}$$

(3)

ahol τ a késleltetési idő, I pedig a detektoron mért intenzitás a t időpontban mért másodpercenkénti fotonszámban. Az elsőrendű korrelációs függvényt, g1-t, a Siegert-összefüggésen1 keresztül nyerjük ki g2-ből, és általában egy kumuláns-illesztést20 alkalmazunk g1-re úgy, hogy,

$${g}^{1}(|{\boldsymbol{q}}|;\tau )=exp(-\bar{\Gamma }(\tau -\frac{{\mu }_{2}}}{2!}{\tau }^{2}+\frac{{\mu }_{3}}{3!}{\tau }^{3}+\ldots ))$$

(4)

hol, $\bar{\Gamma }\,$ a minta összes méretosztályára vonatkozó átlagos, jellemző bomlási sebesség és ${\mu }_{2}/{\bar{\Gamma }}^{2}\,$a másodrendű polidiszperzitási index (PdI), amely leírja a korrelációs függvénynek az egyetlen exponenciális bomlástól való eltérését, és becslést ad a minta szórására. A z-átlagos diffúziós együtthatót, Dz-t, ezután az összefüggés

$$\bar{\\Gamma }={|{\\boldsymbol{q}}|}^{2}{D}_{z}$$

(5)

és az átlagos hidrodinamikai átmérő adja, ZAve, a Dz-ből számított, a gömb alakú részecskékre vonatkozó Stokes-Einstein-modell segítségével, alacsony Reynolds-számú folyadékokban, Eq. 6, ahol η a diszpergálószer viszkozitása, kB a Boltzmann-állandó és T a diszpergálószer hőmérséklete Kelvinben,

$${D}_{z}=\frac{{k}_{B}T}{3\pi \eta {Z}_{Ave}}}$$

(6)

A részecskék méreteloszlásának a kumulánsoknál nagyobb felbontású becslése a korrelációs függvény több exponenciális összegére való illesztésével adható, amelyet számos lehetséges inverziós módszerrel hajtanak végre, mint például a CONTIN28 vagy a nem-negatív legkisebb négyzetek (NNLS), amelyek két általánosan alkalmazott példa, amelyek célja, hogy megbirkózzanak az ilyen illesztés általában rosszul megoldott természetével. A polidiszperz esetre az Eq. 4 egyenletes eloszlássá válik D felett, amelyből kiszámítható a hozzájáruló részecskesugarak vagy átmérők tartománya,

$$${g}^{1}(|{\boldsymbol{q}}}|;\tau )=\int G(\Gamma )\,exp(\,-\,\,\Gamma {\rm{\tau }})d\Gamma $$$

(7)

Az almérések hossza és a pontosság javítása

A fotonok érkezési idősorát kis almérésekre osztjuk, amelyeket aztán egyenként korrelálunk és a 2. szakaszban leírtak szerint a minta tulajdonságaira redukálunk.1 és ezeknek a származtatott mennyiségeknek a mérés előrehaladtával felépített eloszlásait ezután az átmeneti és állandósult állapotú adatok azonosítására használják.

A DLS-adatokból származtatott mennyiségek (ZAve, PdI, számlálási sebesség stb.) kísérleti bizonytalansága több mérésen keresztül a szokásos módon fordítottan arányos a mérések számának négyzetgyökével, azonban az egyes részméréseken belüli korrelogramma zaja és a részmérési hossz közötti kapcsolat kevésbé nyilvánvaló. Emlékeztetve az 1a. ábrára, a mintavételezett térfogat; a megvilágító lézer és a véges szélességű detektálási útvonal metszéspontja által határolt terület lényegesen kisebb, mint a küvettában lévő minta teljes térfogata, ezért az integrációs idő növekedésével nő annak valószínűsége, hogy egy aggregátum be- vagy kilép a detektálási térfogatba, és ebben a szakaszban azt kell megvizsgálni, hogy a származtatott mennyiségek, ZAve és PdI hogyan viselkednek a részmérések időtartamának függvényében. A cél az időtartam optimalizálása a jel-zaj viszony fenntartása vagy javítása érdekében, de olyan részmérési hossz mellett, amely egyidejűleg lehetővé teszi, hogy a szelekciós algoritmus elég érzékeny maradjon ahhoz, hogy az egyes részméréseket állandósult vagy átmeneti állapotúnak minősítse.

A 2a. ábra a ZAve és a PdI értékeit mutatja a gyártó által 58-68 nm-ben megadott hidrodinamikai mérettartományú (Thermo-Scientific, 3060 A), 150 mM NaCl-ban diszpergált, 200 nm szűrt DI-vízzel készített 150 mM NaCl-ban diszpergált polisztirol latex (18.2 MΩ).

Megfigyelhető a mért ZAve feletti standard eltérés csökkenése 1-től.1 nm-re 0,32 nm-re csökken az 1 × 10 s és a 10 × 1 s esetek között, kékkel kiemelve, ami azt jelzi, hogy a DLS-mérés pontossága egyszerűen a rövidebb részmérések átlagának felhasználásával, de azonos teljes integrációs idő mellett növekszik. Hasonló viselkedés figyelhető meg a különböző méretű részecskék mérésénél (lásd a kiegészítő információkat).

A javulás mögött álló mechanizmus magyarázható a korrelációs függvény formájának figyelembevételével, amikor egy tranziens szórót észlelünk. A korrelációs függvény megközelítőleg egy exponenciális bomlás, kis perturbációkkal, amelyek többféle zajforrásnak köszönhetőek, beleértve az impulzusok utáni, lövési zajt, normalizálási hibákat és természetesen a különböző méretű szóró részecskék észlelését21. A korrelált fényszórás rövid időintervallumokban történő rögzítése növelheti e perturbációk amplitúdóját, de a több, véletlenszerű zajt tartalmazó részmérési korrelációs függvények átlagolása azt jelenti, hogy a végeredmény kevesebb zajt tartalmaz, mint az azonos időtartamban rögzített, de egyetlen folyamatos nyomként kezelt korrelációs függvény. Ez egy rendkívül fontos eredmény, mivel azt jelzi, hogy semmi más, mint egy gondosan levezetett almérési hossz, 3-szoros pontosságjavulást eredményez ennél az elsődleges nanoszintű mérési módszernél.

Továbbá, amint azt a következő részben bemutatjuk, a rövidebb almérési hossz lehetővé teszi az állandósult és tranziens adatok osztályozását is, ami, mint azt be fogjuk mutatni, megoldja a DLS egyik elsődleges kritikáját: a szórt intenzitásnak a részecske sugarának hatodik hatványával való arányosságát, ami azt jelenti, hogy az elsődleges részecskekomponensből származó adatokat torzíthatja vagy akár el is takarhatja a ritka nagy részecskék jelenléte. Gyakorlati szempontból ez a gondos mintaelőkészítés szükségességét teszi szükségessé, hogy elkerüljük a mérés eredményében a nagyobb, gyakran nem kívánt frakciók okozta jelentős bizonytalanságokat, például a szűrőtörmelékből, átmeneti aggregátumokból vagy rosszul tisztított laboratóriumi edényekből.

A tranziens és állandósult állapotú adatok osztályozása

Amint korábban említettük, sok kereskedelmi DLS-műszer 10 másodperces nagyságrendű részmérési időt használ, és ezek közül több mérést kombinálnak valamilyen porelutasító algoritmust követve, ez azonban azt jelenti, hogy megbízható adatok nagy része kimaradhat egy mérésből, ha egy részmérés egy tranziens eseményből származó rövid szórást tartalmaz. Ez arra utal, hogy az állandósult és tranziens adatok osztályozása rövidebb korrelációs idők alkalmazásával is elérhető, és ez pontosabbá teheti a részmérések közötti összehasonlítást is, mivel a tranziens szórás hatásait nem átlagolják ki. Ezeknek a részméréseknek az eredményeit ezután az autokorrelációs függvények átlagának elemzésével lehetne kombinálni a méretelemzés elvégzése előtt, amint azt a 2.2. szakasz tárgyalja.

A rögzített részméréseket ezután a rendszer állandósult és tranziens állapotát leíró halmazokba sorolják, vagy más szóval azokba, amelyek az alapul szolgáló, állandósult állapotú mintát reprezentálják, és azokba, amelyek a zavaró szórás kitörésével kapcsolatosak, amint azt az ábra mutatja.

A tranziens részmérések azonosítását a vizsgált minta jellemzőiből kell levezetni, hogy elkerüljük az önkényesen meghatározott küszöbértékek szükségességét, amelyek mintaspecifikusak lehetnek. Az összevont részmérések egyenként történő redukálásával számos lehetséges paraméter áll rendelkezésre, amelyek a részmérési halmazok összehasonlításának alapjául szolgálhatnak, és logikusnak tűnik, hogy ezt az összehasonlítást a mért autokorrelációs függvények méretelemzésére alapozzuk.

A halmazelemzés feltételezi, hogy a minta monodiszperz, ami azt jelenti, hogy mind a ZAve, mind a PdI folyamatos és érzékeny mérőszámokat ad a részecskék méretére, amelyeket a részmérések összehasonlítására használhatunk. A PdI a korrelációs függvénynek a tökéletes exponenciális lecsengéstől való eltérését írja le. Ez a korrelációs függvény perturbációjának közvetlen mérése, és különösen érzékeny a korrelációs függvény alapvonalában fellépő zajra, ami az átmeneti szórás tipikus következménye, és ezért, mint majd megmutatjuk, ideális paraméter a több almérésből származó korrelációs függvények összehasonlítására.

Egy ilyen kapcsolatra példa a 2b. ábrán látható, ahol a minták vagy aggregált anyagot tartalmaznak, vagy latexgömbök keverékével adalékoltak (lásd a kiegészítő információkat). Itt a nyomokban aggregátumot tartalmazó minták pozitív korrelációt mutatnak a mért méret és a PdI között, egyes adatpontok egységes méret és PdI mellett csoportosulnak, míg az adalékolatlan minták jól meghatározott adatklasztereket mutatnak. Az átmeneti almérések tehát azonosíthatók, mint olyanok, amelyek a PdI váratlan értékénél jelentkeznek. Ebben az esetben a váratlan azt jelenti, hogy az adott részmérés PdI értéke nem reprezentatív az állandósult állapotú részmérésekre nézve, és ezért statisztikai kiugró érték. A statisztikai kiugró értékek azonosítására számos módszer létezik, mindegyiknek megvannak az erősségei és gyengeségei a vizsgált eloszlás jellegétől és a minta méretétől függően.

A 3a. ábra a PdI eloszlásait mutatja olyan diszperziók esetében, amelyek tetszőlegesen kis mennyiségű zavaró anyagot tartalmaznak, a PdI eloszlásainak középpontja és szélessége a különböző minták esetében változik. Tekintettel arra, hogy a PdI definíció szerint az intervallumra korlátozódik, és általában a nagyobb értékek felé ferde, az eloszlás számtani leírói, mint például az átlag és a szórás, nem megfelelőek.

Ahol a diszkrét részmérések száma elég nagy, ott az adatok hisztogramja felhasználható az eloszlás szélességének levezetésére (lásd a Gauss-illesztéseket az ábrán). 3a. ábra), azonban ha a minta mérete kisebb, a Dixon29 és Rosner30 által leírt numerikus hipotézisvizsgálati módszerek megfelelőbbek lehetnek, 3b. ábra.

A minta méretének optimalizálása

A kiugró értékek azonosítási módszerének hatékonysága mind az adatpontok teljes számától, mind az eloszláson belüli kiugró értékek számától függ. Például a 2a. ábrán látható jól előkészített, monodiszperz és stabil minta azt mutatja, hogy már 10 átlagolt, 1 s időtartamú részmérésből is megbízható méret jelenthető, míg egy olyan minta, amely zajosabb korrelációs függvényeket produkál, akár az alacsony szórás, akár a jelentős polydiszperzitás, akár a zavaró szórások miatt, nagyobb számú részmérést igényel, hogy nagyobb biztonsággal lehessen azonosítani a kiugró értékeket. Ez ismét a minta által vezérelt megközelítést motiválja, ahol a részmérések száma a mintából gyűjtött adatok minőségétől függ.

A lehetséges megközelítések között szerepelhet az egyes részmérési eredmények szórásának figyelemmel kísérése, vagy a normalitás vizsgálatának elvégzése ezeken az értékeken, ez azonban jellemzően nagyobb számú adatpont megszerzésére ösztönözné a mérést. Egy alternatív megközelítés a mérés előrehaladtával a leendő végeredmény folyamatos figyelemmel kísérése, ahol a mérés statisztikája megfelelően jól meghatározott, és a korrelációs függvény perturbációit megfelelően jól átlagolják a végeredményből, a bejelentett méretnek a természetes szórás bizonyos fokán belül állandóvá kell válnia. Ismét hipotézisvizsgálatokkal lehet összehasonlítani a mérés várható eredményét a további részmérések összegyűjtése után, és ha ezek az értékek megegyeznek, akkor a minta megfelelően jellemezhető, és a mérés ennek megfelelően befejezhető. További biztonságot adhatunk ennek a módszernek azáltal, hogy a mérés során az eredményekben különleges okokat, például tendenciát és oszcillációt keresünk.

Ez a megközelítés egy példája a 4a. ábrán látható egy lizozim-mintánál, ahol kezdetben a részecskeméret hibás alulbecslését jelentették, amely azonban a további részmérések gyűjtésével stabilizálódik. Vegyük észre azt is, hogy a kiugró értékek azonosítása a mérés során megismétlődik, ahogy egyre több adatot gyűjtünk, ami azt jelenti, hogy egy átmeneti eseményt ilyenként azonosítunk, függetlenül attól, hogy a mérési folyamat során mikor rögzítették. Ez előrelépés más módszerekhez képest, amelyek az adatokat egy kezdeti mérés alapján hasonlíthatják össze, amely lehet, hogy reprezentatív volt vagy nem volt reprezentatív a valódi mintára nézve.

Az adatgyűjtés hatékonysága a felhasználó beavatkozása nélkül javul, így a kevesebb adatgyűjtést igénylő stabil minták mérései rövidebb idő alatt elvégezhetők, míg a bizonyos szintű bizonytalanságot mutató összetett minták esetében automatikusan nagyobb mennyiségű adatot kell gyűjteni ahhoz, hogy hasonló megbízhatóságú eredményt kapjunk.

Mintaoptimalizálás

A 2.2. szakaszban leírtak szerint a korrelációs függvényben számos zajforrás van, és e zaj amplitúdója időfüggő lehet. Bár a 2.2. szakaszban a rövid korrelációs idők használata mellett érveltünk, vannak olyan esetek, amikor ez hátrányos lehet.

Egy olyan minta esetében, amely alacsony szórási tulajdonságokkal rendelkezik, akár kis szórási keresztmetszet, akár alacsony mintakoncentráció, akár a környező diszpergenshez képest kis törésmutató-különbség vagy ezek kombinációja miatt, kevesebb detektált foton tölti ki a korrelátor időbínjait, és ez jellemzően a korrelációs függvény alapvonalán zajként jelentkezik a hosszabb korrelátor késleltetési idő, τ esetén.

A kereskedelmi fényszórásos műszerek jellemzően számos műszeres beállítást változtatnak a mérési beállítási eljárás részeként, mint például a mérési pozíció optimalizálása a küvettán belül, hogy minimalizálják a bejövő lézer és a kimenő szórás detektálási útvonalának optikai úthosszát, hogy elkerüljék a többszörös szórást a küvetta közepéhez közeli koncentrált mintákból, vagy fordítva, hogy elkerüljék a sejtfal statikus szórását alacsony mintakoncentráció esetén, és a detektált fotonszámítási sebesség optimalizálása, hogy a detektor lineáris tartományán belül maradjon. Ezeket a műszeres optimalizálásokat általában úgy tervezték, hogy a fényszórásos adatok értelmezésében járatlan felhasználók a lehető legmegbízhatóbb eredményeket kapják a mintakoncentrációk és -méretek széles tartományában, de ilyen optimalizálást korábban nem alkalmaztak a korrelációs időre. Erre egy példa a 4b. ábrán látható, ahol egy 1,0 mg/ml lizozimból álló, 90°-os detektálási szögben mért minta részecskeméret-eloszlása látható. A rövid korrelációs időre jelentett PSD a fő részecskecsúcs mellett egy nyilvánvalóan nagyméretű komponenst is mutat). Ha ez valódi mintahatás lenne, akkor a kisebb detektálási szögnél végzett mérések ugyanezt a nagy komponenst mutatták volna. Az ugyanerre a mintára végzett előre szórásmérések monomodálisak voltak (lásd SI), és a csúcs hiánya a mért adatokban más detektálási szögeknél (Kiegészítő információk) azt jelzi, hogy ez az alacsony szórású minta és a statikus szórás kombinációjából adódhatott, esetleg az eldobható mintaküvettából. Miközben a beeső fény intenzitása optimalizálható, egyes minták, mint például az alacsony koncentrációjú fehérjék, még a megvilágító lézer csillapítása nélkül is az optimálisnál kevesebb fotont szórhatnak, ami azt jelenti, hogy a kereskedelmi dinamikus fényszórásos rendszer standard működési folyamatai nem feltétlenül optimálisak, és hosszabb korrelációs időt lehet használni24 , és e beállítások meghatározásához kiterjedt módszerfejlesztésre van szükség. Ezért bevezethető a mérés egy további minta által vezérelt adaptációja, amelynek során a műszer a lehető legrövidebb almérési hosszt használja, amely optimális mérendő fotonszámot eredményez (lásd SI), és ezt a következő szakaszban az optimalizált mérési séma ismerteti.

Az optimális mérési séma

Az optimális mérési séma a következő folyamatból áll:

(1)
A mérési pozíció és a beeső fényintenzitás optimalizálása.
(2)
Ha az észlelt szórási szint még a legkisebb lézercsillapítás mellett is alacsony, a részmérési hosszat optimalizálják az alapvonalzaj csökkentése érdekében.
(3)
A részméréseket összegyűjtik és kumulánselemzéssel elemzik.
(4)
Az elemzésekből származó PdI-értékeket összehasonlítják és azonosítják a kiugró értékeket.
(5)
Az állandósult állapotú részmérések korrelációs függvényeit átlagolják, és az eredményt elemezve ZAve-t jelentenek.
(6)
Újabb részméréseket rögzítenek és elemeznek a fentiek szerint, és egy új végső válasz ZAve-t rögzítenek.
(7)
Ezt a folyamatot addig ismételjük, amíg az (5) és (6) lépésben kapott két előző ZAve eredményt hipotézisvizsgálat segítségével egybehangzónak nem találjuk.
(8)
A tranziens részméréseket is átlagoljuk és elemezzük, hogy információt kapjunk a tranziens komponensről.

A fenti algoritmusnak a minta jellemzőire adott válaszát tekintve – a részmérések hossza, az összegyűjtött adatok mennyisége és az, hogy mely részméréseket kell kihagyni a stabil állapotú eredményből, mind a minta és az adatok minőségétől függ – a módszert adaptív korrelációnak nevezik, az adaptív optikának a csillagászatban31 való alkalmazásából merítve, ahol az adatok visszacsatolását használják a megfigyelt aberrációk korrigálására.

Az adaptív optikát a csillagászatban használják31 , ahol az adatok visszacsatolását használják a megfigyelt aberrációk korrigálására.

Universe