Kémiai derivatizáció a bioanalízisben

Alkalmazások

A kémiai derivatizáció már régóta bizonyított analitikai technikaként a bioanalízisben az alacsony ionizációs hatékonysággal, a vegyületek instabilitásával, a gyenge szelektivitással vagy elfogadhatatlan kromatográfiás teljesítménnyel (rossz retenció, rossz csúcsforma és hordozási problémák), sőt a GC elválasztás rossz illékonyságával kapcsolatos problémák megoldására. Ez a technika hatékony eszköz a kémia számos területén, beleértve az orvosi, törvényszéki, élelmiszer-tudományi, doppingellenőrzési és környezetvédelmi szakterületeket. A kémiai deriválás célja az analit (nukleofil vagy elektrofil) szerkezetének módosítása egy kémiai reagens (az analit természetétől függően elektrofil vagy nukleofil) segítségével, és ennek eredményeként egy új vegyület (a reakció származéka) jön létre, amely jobb kémiai és fizikai tulajdonságokkal rendelkezik az elemzéshez. A reakciókörülményeket (a reagens mennyisége, a reakcióidő és a hőmérséklet stb.) úgy optimalizáljuk, hogy a kívánt származék a lehető legnagyobb reakcióhozammal keletkezzen. Kiegészítő mintatisztítási eljárások fejleszthetők ki a nem kívánt melléktermékek és a felesleges reagensek eltávolítására, ezáltal minimalizálva az analízis során az analitre vonatkozó következtetéseket.

A kémiai deriválás alkalmazásával a lehetetlen analízise is lehetővé válik. Erre számos példát mutattak be az irodalomban; hatással van a GC, az LC-MS/MS és az NMR detektálásra. A legjelentősebb az enantiomerek kromatográfiás elválasztása királis deriválással, specifikus reszolváló reagensek felhasználásával, speciális királis oszlopok és elválasztási feltételek használata nélkül .

Figyelmeztetések

A megfelelő kémiai reagens kiválasztása elengedhetetlen a sikeres deriváláshoz, és a konkrét alkalmazástól függ. Általában, ha a célanalit nukleofil (elektronfelesleggel rendelkező vegyület), akkor egy elektrofilt (általános elektronhiánnyal rendelkező vegyületeket) választunk reagensnek, és fordítva. A reagenseknek szelektívnek kell lenniük (a molekula egy adott helyét kell megcélozniuk), ezáltal elkerülve a célmolekula, a metabolitok vagy az endogén komponensek több helyen történő derivatizálását. Például egy hidroxil- és aminofunkciós csoportokat egyaránt tartalmazó molekula esetében kerülni kell a savkloridok vagy anhidridek deriválási reagensként való használatát, mivel ezek mindkét funkciós csoportot derivatizálják. Ezzel szemben a danzil-klorid mint deriválási reagens használata megfelelő az amino- és fenol funkciós csoportok esetében, mivel nem lép reakcióba az alifás alkoholokkal. A reagens kiválasztásakor figyelembe veendő egyéb követelmények közé tartozik a hozzáférhetőség (kereskedelmi forgalomban), a tisztaság és a költség. Jellemzően a reagensek költsége minimális, és ezért nem jelent akadályt a használatban.

A kémiai deriválási eljárások optimalizált feltételek mellett általában elég robusztusak ahhoz, hogy gyógyszeripari bioanalízisben is alkalmazhatók legyenek, és képesek megfelelni a szabályozási elvárásoknak. Ezt általában egy szigorú validálási folyamat során bizonyítják, ahol számos paraméter, többek között, de nem kizárólagosan a pontosság, precizitás, szelektivitás, mátrixhatás stb. A belső standard kiválasztása alapvető fontosságú a mintakezelés és a bioanalízis különböző lépései során bekövetkező esetleges analitveszteségek korrigálása érdekében; ezáltal biztosítva a vizsgálat robusztusságát. Ha lehetséges, deutérium- vagy 13C-stabil belső standardot kell használni, máskülönben egy hasonló reaktivitású, visszanyerési és kromatográfiás tulajdonságokkal rendelkező analógot lehet helyettesíteni. Továbbá, ahol lehetséges, feltétlenül figyelembe kell venni és értékelni kell az adott analit metabolikus útjait; a származékképzési eljárás során el kell kerülni a metabolitok visszaalakítását az alapmolekulává, mivel ezek a folyamatok gyakran kemény körülményekkel járnak (pH, hő, hosszú inkubációs idő stb.). Sajnos ezt megnehezítheti a metabolitok referenciastandardjainak hiánya, valamint a differenciált vagy gyorsított fejlesztési stratégiák miatt a gyógyszerfejlesztési életciklus korai szakaszában a metabolikus információk hiánya.

A kémiai derivatizálás mint művészet

A kémiai derivatizálás alkalmazása az utóbbi években csökkent, mivel új elválasztási technológiák fejlődtek és váltak általánossá. A szuperkritikus folyadékkromatográfia (SFC) fejlődése például új utat nyitott a királis sztereoizomer analízis számára; ezáltal bizonyos esetekben csökkentette a királis deriválás szükségességét . A háromszoros kvadrupolos tömegspektrometriás műszerek érzékenyebb generációi új vagy továbbfejlesztett ionizációs technológiákkal a kimutatási határokat alacsony pikogrammos szintre tolják, és ennek eredményeként csökkent az igény a kémiai derivatizálás iránt a vizsgálati érzékenység javítása érdekében (javított ionizáció vagy szelektivitás révén). Más technológiák, többek között az UHPLC; mikro-/nano-LC (a jobb ionizációs hatékonyság érdekében); ionmobilitási képességgel rendelkező TOF-műszerek (elektronikus elválasztás, nem pedig kémiai/fizikai) szintén hozzájárultak a kémiai deriválás csökkenéséhez a bioanalitikai laboratóriumokban. Ezzel együtt azonban a technikát még mindig alkalmazzák nagyon összetett elválasztásoknál, ahol a fent említett technológiák nem tudnak megfelelő hatást gyakorolni. Néha a kémiai deriválásnak a fenti technológiák valamelyikével való összekapcsolása fokozott/additív hatást fejt ki. Különösen az SFC királis derivatizálással való kombinációja bizonyult jobbnak királis elválasztás esetén, mint az SFC analízis (az adatok nem láthatóak).

A technika e hanyatlása és más analitikai technikákkal összehasonlított összetettsége miatt a kémiai derivatizálás egy speciális “művészeti formává” fejlődött a laboratóriumban, amely speciális készségeket igényel, erős kémiai jártassággal kombinálva. Ennek következtében a DMPK-környezetben kevesebb tudósnak sikerül elsajátítania a technikát és gyakorlottá válnia annak alkalmazásában. A kérdés tehát az, hogyan lehet ezeket a készségeket megőrizni és átadni az analitikus tudósok következő generációinak. Az ehhez hasonló különszámok, áttekintő cikkek, könyvfejezetek, kísérleti protokollokat tartalmazó útmutatók remélhetőleg megkönnyítik és elősegítik a kémiai deriválás, mint nagyszerű analitikai eszköz használatát.

Tervezet

Ez a tematikus szám a bioanalitikai kutatásban használt, meglévő deriválási technikák terén elért előrelépéseket, valamint innovatív új módszereket és megközelítéseket (pl., a derivatizálás kombinálása mikroáramú LC-MS-szel, valamint az új kémiai jelölési technikák ötlete Niwa és munkatársai által).

A szám célja, hogy a következő aspektusokkal kapcsolatos szempontokkal foglalkozzon:

• Derivatizációs módszerek az LC-MS bioanalízisben (beleértve a HPLC-t is);

• Peptidderivatizáció fehérjeterapeutikumok elemzéséhez;

• biológiai mintákra alkalmazott királis derivatizációs reagensek (lásd Vashistha et al. );

• Derivatizáció endogén vegyületek elemzésére (lásd: “Beyond Classical Derivatization: Analyte ‘derivatives’ in bioanalysis of endogenous and exogenous compounds” (Barnaby et al., vagy “Derivatization of steroids in biological samples for GC-MS and LC-MS analyses” (Marcos et al. );

• Derivatization procedures in human dopping control (lásd az Athanasiadou et al. érdekes áttekintését. ).

Míg igaz, hogy a kémiai deriválás csak egy újabb eszköz a bioanalitikai eszköztárban, egy DMPK-laboratórium számára “kötelező”, és továbbra is hatással lesz számos bioanalitikai kihívás kezelésére.

Ezért, ha nem tetszik az analit, változtassa meg (mármint a kémiai deriválással)!