Guanidin

Membránfehérjék

A guanidin és az SDS oldatok denaturáló oldószerek, de természetesen a membránfehérjék natív állapotát is szerettük volna jellemezni. A nehézséget itt az jelentette, hogy még nem volt konszenzus a natív állapot meghatározásában vagy felfogásában – ami a magunkfajta újoncok számára bizonytalanságot jelentett, mivel nem rendelkeztünk olyan tapasztalattal, amely lehetővé tette volna számunkra, hogy éleslátóan megtippeljük, hogy a vitatott elképzelések közül melyik bizonyulhat helyesnek.

Még a foszfolipid kettősréteg, a sejtmembránok legminimálisabb megértéséhez nélkülözhetetlen fogalom is vitatott volt, annak ellenére, hogy közel 50 évvel korábban mutatták ki először a vörösvértestekben, és hogy a termodinamika alapján valóban ez volt az egyetlen elképzelhető elrendeződés, ami Irving Langmuir 1917-es klasszikus, amfifil anyagok monorétegével végzett méréseinek közvetlen következménye. A kétrétegűség fogalmának az azóta eltelt időszakban történt nevetségesen lassú elfogadását a Ben Franklin Stilled the Waves című könyvemben írtam le. A lényeg itt az, hogy a szkepticizmus még mindig fennállt, amikor mi is bekapcsolódtunk a membránkutatásba.

És azok között, akik meg voltak győződve a lipid kettősrétegről, a fehérjék membránokba való beépülésének módja még mindig vita tárgyát képezte. Néhányan, mint például Duke-os kollégánk, David Robertson, vonakodtak elhinni, hogy a fehérjék valóban képesek áthatolni vagy áthatolni a kettősrétegen. A 3. ábrán a New York-i Tudományos Akadémia 1972-es konferenciáján készült két meglehetősen eltérő koncepciójú kép látható. Az egyik Robertson “egységmembránja”, amelyen a fehérjék teljesen kívül vannak. A másik Vanderkooi elképzelése a citokróm-oxidáz komplexekről a mitokondriális membránokban: a fehérje reálisabban helyezkedik el, de még nincs elképzelés a különálló hidrofil és hidrofób doménekről és arról, hogy ezek hogyan határozzák meg a fehérje-lipid kölcsönhatást. Később, még ugyanebben az 1972-es évben a foszfolipid kettősrétegek immár hagyományos idealizált képe, melyen a működő fehérjék végigfutnak, végül Singer és Nicolson “folyadékmozaik” modellje által vált népszerűvé .

3. ábra. A membránfehérjék két eltérő koncepcionális képe, mindkettőt ugyanazon a New York-i ülésen javasolták 1972-ben : (a) Robertson úgy gondolta, hogy a fehérjék aszimmetrikusan helyezkednek el, a két kettősréteg felszínén kívül; (b) Vanderkooi nézete a citokróm-oxidáz komplexekről keresztmetszetben.

A laboratóriumban ezek izgalmas idők voltak, a legizgalmasabbak, amelyekre emlékszem. Megtanultuk, hogyan használjunk jóindulatú detergenseket, amelyek az SDS-től eltérően durva denaturáció nélkül képesek szolubilizálni a membránfehérjéket a natív állapotot szimuláló környezetben, de olyan környezetben, ahol a molekuláris jellemzéshez is könnyen hozzáférhetővé válnak – egy olyan előrelépés, amelyben részben két szimpatikus finn fiatalember, Kai Simons és Ari Helenius előzött meg bennünket.

A gyakorlatban még mindig többnyire a molekulatömeg mérésére és arra a kérdésre szorítkoztunk, hogy hány polipeptidlánc van molekulánként, de a fehérjéket, amelyekre ezeket a kérdéseket vonatkoztattuk, detergenskezeléssel elválasztottuk a többi membránkomponensektől. A legfontosabb, hogy a fehérjék közül soknak ismert sejtfunkciója volt, és a méréseink ezekre a funkciókra vonatkoztak. A vörösvértesteket már említettem, de valójában számos biológiailag releváns témát sikerült lefednünk, amit sok esetben a diákok missziós buzgalma serkentett. Például egy élettan szakos hallgató, Stuart Grefrath, aki érdeklődött a neurofiziológia iránt, eljött a laboratóriumunkba, hogy megszámolja egy gerjeszthető membrán polipeptidláncait – ebben az esetben a garfish szaglóidegéből -, és ez vezetett minket ahhoz, hogy később több más aktív transzportrendszerrel is foglalkozzunk. (Maga Stuart sajnos egy veleszületett szív- és érrendszeri betegség következtében meghalt, mielőtt független karrierrel beváltotta volna korai ígéretét). Az agyi mielin volt egy másik membrán az idegrendszerből, amelyet megvizsgáltunk .

Ezeken kívül érdemes kiemelni a laboratórium két látogatóját, akik úgy döntöttek, hogy együtt dolgoznak: Neal Robinson, egy posztdoktori ösztöndíjas, és Leon Visser, aki a dél-afrikai Pretoriában, a CSIR-nél töltötte szabadságát). Nagyon szép munkát végeztek a citokróm b5 doménszerkezetének kvantitatív meghatározásában, ami egyfajta prototípusa annak illusztrálására, hogy a membránfehérjék hogyan kapcsolódnak a membránokhoz, és mégis ellátják funkciójukat a szomszédos citoplazmában .

Más projektekben távoli kollégák kéréseire válaszoltunk. Már említettem az Arthur Karlinnal közösen végzett munkát az elektromos halak acetilkolin-receptorával kapcsolatban. Egy másik példa volt a bakteriorhodopszin, amellyel kapcsolatban a Kaliforniai Egyetemről Walter Stoeckenius kérésére detergens oldatban végeztünk méréseket . Itt egy fontos kérdés merült fel, amely e fehérje protonpumpáló aktivitásának mechanizmusához kapcsolódik: a natív fehérje funkcionálisan monomer, vagy (ahogy egyes adatok sugallni látszottak) trimer? A mi szolubilizált fehérjénk kétségtelenül monomer volt, és a spektrális bizonyítékok azt mutatták, hogy a molekuláris változásoknak ugyanazon a ciklusán megy keresztül, mint a natív membránban.

A legtöbb esetben mi magunk nem kapcsolódtunk be közvetlenül abba, hogy megpróbáljuk megfejteni a receptorok, a pumpák vagy a csatornák működését, de elkerülhetetlenül tudatára ébredtünk a problémáknak. Ez valóban gazdagító tapasztalat volt, egészen más, mint azokban az időkben, amikor a szérumalbumin és a β-laktoglobulin (amelyeket kereskedelmi beszállítóktól kaptunk) voltak kutatásaink elsődleges célpontjai.

Az ionpumpák esetében valóban belemerültünk a fiziológiába, többnyire a hipotézis vagy az elmélet szintjén; megtanultuk, hogyan kell kinetikai sémákat számítógéppel modellezni; részt vettünk a megfelelő konferenciákon stb. Az utolsó szombati szabadságunk – a heidelbergi Max Planck Intézetbe – ebből a szempontból fontos volt. A Duke fiziológiai tanszékének elnöke, Ted Johnson, ez alkalommal csatlakozott hozzánk, így hárman voltunk aktív együttműködésben. Ted már régóta számítógép-rajongó volt, és a fiziológiai kar minden egyes tagját csatlakoztatta az észak-karolinai Research Triangle központi számítógépes létesítményhez, mielőtt még divat lett volna a tanszéki pénzeket ilyen módon elkölteni. Akkoriban saját programokat kellett írnunk a számítógépre, ami nehéz volt számomra, de azt hiszem, hasznos eredményeket értünk el, főként az ATP által hajtott Na,K pumpa pumpaciklusának kinetikai modelljeivel kapcsolatban. Rendhagyó munkaidőben dolgoztunk, beleértve a hétvégéket és az ünnepnapokat is, ami néha kellemetlenül érintette heidelbergi házigazdáinkat, akik megszokták, hogy kikapcsolják a központi fűtést, amikor a laboratóriumnak üresnek kellett volna lennie. Körülbelül tíznaponta átkocsikáztunk a határon Strasbourgba egy ínyenc ebédre – elzászi borok kíséretében, amelyek ízét azóta is élvezzük.