Gamma-Glutamil transzpeptidáz

Aktivitás és specificitás

Az enzim által katalizált reakciót tehát általában úgy értelmezik, hogy a reakció körülményeitől függően a γ-glutamilcsoportot különböző akceptormolekulákra, például vízre, aminosavakra, dipeptidekre és magára a γ-glutamil-donorra viszik át. Ezek a katalitikus tulajdonságok a GGT katalitikus mechanizmusához kapcsolódnak, amelyben a reakció egy acilező-deaciláló kettős elmozdulási mechanizmussal megy végbe egy γ-glutamil-enzim intermedieren keresztül.

Amint az a természetes szubsztrát glutation és származékainak szerkezetéből várható volt, a GGT szigorúan felismeri a γ-glutamil-részt, de meglehetősen széles szubsztrátspecifitással rendelkezik a távozó csoport (Xaa) tekintetében. A glutation, annak S-konjugátumai, glutation-diszulfid, γ-glutamil di- vagy tripeptidek, glutamin, γ-glutamilamidok l-α-metil származékai, leukotrién C4, poli-γ-glutamil származékok mind elfogadható szubsztrátként . Az olyan mesterséges szubsztrátok, mint az l-γ-glutamil-p-nitroanilid (l-γ-Glu-pNA) és a fluoreszcens l-γ-glutamil-7-amino-4-metil-kumarin (l-γ-Glu-AMC) aktív szubsztrátok, amelyeket általában γ-glutamil akceptorok (lásd alább) jelenlétében vagy hiányában használnak transzpeptidáz vagy hidroláz vizsgálathoz.

A szubsztrátspecifikusságot az akceptor tekintetében a patkányvese GGT-vel vizsgálták a legkiterjedtebben . A semleges aminosavak l-izomerjei, mint az l-cisztin, l-Gln, l-Met, l-Ala, l-Cys és l-Ser jó akceptorok, de a hidrofób és elágazó láncú aminosavak, mint az l-Phe, l-Trp, l-Leu, l-Ile és l-Val meglehetősen rossz szubsztrátok. d-aminosavak és α-szubsztituált aminosavak nem viselkednek akceptor szubsztrátként. Ezért a d-γ-Glu-pNA használata kényelmes módja az autotranszpeptidáció elnyomásának a hidroláz-aktivitás mérésekor . Mivel az akceptor-kötőhely átfedésben van a glutation Cys-Gly részének alhelyeivel, az enzim a C-terminális Gly-vel rendelkező dipeptideket, mint például az l-Met-Gly, l-Gln-Gly, l-Ala-Gly, l-cisztinil-bisz-Gly, Gly-Gly és l-Ser-Gly, részesíti előnyben akceptor szubsztrátként a relatív aktivitás csökkenő sorrendjében . A kettőnél több aminosavmaradékot tartalmazó peptidek nagyon gyenge akceptorok. Az akceptor aminosavak és dipeptidek Km értékei viszonylag magasak, 0,1 és 5 mM közötti tartományba esnek, de a Gly-Gly (Km=3 mM) a legkényelmesebb a transzpeptidáz aktivitáshoz használt akceptor szubsztrátként. Az akceptormolekulák magas koncentrációi kompetitív módon gátolják a GGT-t a γ-glutamil donorral (γ-Glu-Xaa) szemben, valószínűleg a Xaa és az akceptor kötőhelyének átfedése miatt. A szubsztrátspecifitás a Cys alhely tekintetében az enzim eredetétől függ; az E. coli enzim például a bázikus aminosavakat (l-Arg, l-Lys és l-His) és az aromás aminosavakat (l-Phe, l-Trp és l-DOPA) preferálja ezen a helyen. Az akceptorspecifikussággal azonban óvatosan kell bánni, mert a látszólagos aktivitás az adott pH-n rendelkezésre álló deprotonált aminosav tényleges koncentrációjától is függ. A Gly-Gly esetében megfigyelt viszonylag magas aktivitás részben e dipeptid alacsony pKa értékének köszönhető . Úgy tűnik, hogy az akceptorszubsztrátok deprotonált aminocsoportjai szükségesek a transzpeptidációhoz.

Az enzimvizsgálatokhoz leggyakrabban használt donorszubsztrát az l-γ-Glu-pNA. A patkányvese enzim transzpeptidáz aktivitásának tipikus vizsgálati keveréke 5 mM l-γ-Glu-pNA, 100 mM Gly-Gly 0,1 M Tris-HCl-ben (pH 8,0) 25°C-on. A Gly-Gly megfelelő koncentrációjának hozzáadása hatékonyan elnyomja a hidrolízist és az autotranszpeptidációt. A GGT optimális pH-ja körülbelül 7,5-9 a transzpeptidációhoz, de a pH-függés sokkal kisebb a hidrolízishez . Ez összhangban van azzal a ténnyel, hogy a látszólagos transzpeptidáz aktivitás részben az akceptorok szabad aminocsoportjának hatékony koncentrációjától függ .

A glutaminra vonatkozó hidroláz aktivitás akár 12-szeresére is nő az akceptorhely irányított modulátorok, például maleát, hippurát és glikokolát hozzáadásával. E vegyületek hozzáadása gátolja az akceptor szubsztrátok és a Cys-Gly alhelyeket elfoglaló γ-glutamil donorok kötődését. A γ-glutamil-donorok hozzáadása vagy a γ-glutamil-donorhelyen lévő inhibitorok kötődése növeli e modulátorok affinitását, ami a γ-glutamil-donorok és az akceptorok kötőhelyei közötti kooperatív kölcsönhatásokra utal (áttekintésért lásd Tate & Meister ). Az e modulátorok által elfoglalt akceptorhely feltételezhetően elősegíti a GGT konformációváltását aktív formába, ezáltal megkönnyítve egy átmeneti állapot kialakulását. Ezt javasolják az emlős enzimek inaktiválódási sebességének acivicin általi növelésére is (vide infra), de ez nem volt megfigyelhető egy γ-monofluorofoszfonát, egy aktív-hely irányított átmeneti állapot analóg affinitásjelzővel történő gátlásnál . Úgy tűnik, hogy az acivicin az emlős GGT katalitikus nukleofiljától eltérő nukleofil maradékhoz kötődik .

A GGT-t reverzibilisen és kompetitívan gátolja az l- és d-γ-glutamil-(o-karboxi)fenilhidrazid (antglutin, amelyet a Penicillium oxalicum termel) 8 μM Ki értékkel, és egerek esetében nem jelentettek akut toxicitást . Több, a γ-karboxi közelében lévő reaktív csoportot tartalmazó glutamátanalóg irreverzibilis gátlóként hat. A 6-diazo-5-oxo-l-norleucin (DON), az O-diazoacetil-l-szerin (l-azaserin) és az l-(αS,5S)-α-amino-3-klór-4,5-dihidro-5-izoxazolecetsav (acivicin vagy AT-125, amelyet Streptomyces sviceus állít elő) a GGT erős, de nem specifikus inaktivátorai . Az acivicint széles körben használták a GGT in vivo aktivitásának elnyomására , bár az acivicin erősen toxikus, mivel inaktivál számos, a nukleotidok, aminosavak és aminocukrok bioszintézisében részt vevő glutamin-amidotranszferázt . A szerin-borát komplex reverzibilisen kötődik a γ-glutamil kötőhelyhez, hogy 20 μM Ki értékkel gátolja a GGT-t . Ez a klasszikus felfedezés vezetett egy erős és lassan kötődő inhibitorhoz, az l-2-amino-3-boronobutánsavhoz (γ-boroGlu) . A GGT-t 17 vagy 35 nM teljes Ki értékkel gátolja, de a gátlás még mindig reverzibilis. A 2-Amino-4-(fluorofoszfono)butánsav (γ-PFGlu), egy glutamát-analóg, amelynek a γ-karboxiát egy elektrofil foszfor helyettesíti, az E. coli GGT hatékony mechanizmuson alapuló és aktív hely irányított affinitásjelölő szer . Ez a vegyület gyorsan és irreverzibilisen gátolja a GGT-t, és stabil, anionos és tetraéderes átmeneti állapot-szerű adduktot képez, amely alkalmas peptidtérképezésre az E. coli GGT katalitikus nukleofiljének azonosítására (vide infra). A γ-(monofenil)-foszfono- és γ-foszfonodiészter-glutamátanalógok egy sorozata olyan mechanizmusalapú inhibitorok, amelyek a GGT-t a katalitikus nukleofil kovalens módosításával irreverzibilisen gátolják. Különösen a Cys-Gly szerkezeti mimikáját és annak C-terminális karboxicsoportját tartalmazó γ-foszfonodiészterek mutatnak rendkívül magas aktivitást a humán GGT-vel szemben, az inaktiválási sebesség 130-6000-szer gyorsabb, mint az aciviciné. A gátlás szelektív a GGT-re, és nem figyelhető meg toxicitás. Az egyik ilyen inhibitor kereskedelmi forgalomban “GGsTop” néven kapható (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

A humán GGT nem-glutamát analóg inhibitorát nagy áteresztőképességű szűréssel találták meg . Ez a vegyület a γ-glutamil szubsztrát komplex akceptor helyét foglalja el 17,6 μM Ki értékkel. Az inhibitor fajszelektív, de reverzibilis, és némi toxicitásról számoltak be.

A GGT által katalizált reakció feltehetően ping-pong mechanizmussal zajlik egy γ-glutamil-enzim intermedieren keresztül, ahogy azt a szerin-hidrolázoknál megfigyelték . Az N-terminális Thr Oγ a kis alegységben a katalitikus nukleofil, amelyhez egy γ-glutamilcsoport kapcsolódik (lásd szerkezeti kémia). A GGT katalitikus nukleofiljét először az E. coli GGT-nél azonosították a kis alegység N-terminális Thr-maradékaként (Thr391) a γ-PFGlu-val inaktivált enzim peptidtérképezésével. Ez a Thr380-nak (patkány veseenzim) és Thr381-nek (humán enzim) megfelelő maradék konzerválódik az összes olyan GGT között, amelynek elsődleges szekvenciája ismert. A humán GGT katalitikus nukleofiljét Thr381-ként azonosították a γ-(monofenil)-foszfon-affinitásjelzővel inaktivált enzim peptidtérképezésével . A GGT által katalizált reakció tehát a kis alegység N-terminális Thr-maradékának nukleofil támadásával kezdődik a donor szubsztrát (γ-Glu-Xaa) γ-karboxiján a Xaa eliminálása érdekében. Az így keletkezett γ-glutamil enzim a sebességet meghatározó lépésben vízzel (hidrolízis) vagy aminosavakkal és dipeptidekkel (transzpeptidáció és autotranszpeptidáció) reagál .

A GGT az N-terminális nukleofil hidrolázok (Ntn-hidrolázok) tagja, amint azt az egyedi hajtás és az érési folyamat előre jelzi, amelyben a katalitikusan inaktív prekurzor poszttranszlációs autokatalitikus feldolgozásával az érett enzim aktív dimer formája keletkezik. Ezt hely-irányított mutagenezissel és a bakteriális enzimek röntgenszerkezeti analízisével is megerősítették (lásd Szerkezeti kémia).