Gélszűréses kromatográfia

Gélszűréses kromatográfia alkalmazások

A gélszűréses kromatográfia, a méretkizárásos kromatográfia egyik típusa, használható a mintában lévő molekulák és komplexek meghatározott mérettartományba tartozó frakciókra történő frakcionálására, a meghatározott méretnél nagyobb molekulák eltávolítására a mintából, vagy a két művelet kombinációjára. A gélszűréses kromatográfia alkalmazható olyan vegyületek, mint például kis molekulák, fehérjék, fehérjekomplexek, poliszacharidok és nukleinsavak elválasztására, ha azok vizes oldatban vannak. Ha mozgófázisként szerves oldószert használnak, az eljárást gélpermeációs kromatográfiának nevezik.

A gélszűréses kromatográfia használható még:

• Molekulák és komplexek frakcionálása egy előre meghatározott mérettartományon belül
• Méretelemzés és -meghatározás
• Nagy fehérjék és komplexek eltávolítása
• Puffercsere
• Sótalanítás
• Kismolekulák, például nukleotidok, primerek, festékek eltávolítása, és szennyeződések
• A minta tisztaságának értékelése
• A kötött és nem kötött radioizotópok szétválasztása

A fenti felhasználási célokra alkalmas gélszűrő kromatográfiás közegek előrecsomagolt gravitációs áramlású oszlopok, spin oszlopok, alacsony és közepes nyomású kromatográfiás oszlopok és palackozott gyanták formájában állnak rendelkezésre.

Gélszűréses kromatográfia mechanizmusa

A gélszűréses kromatográfiás oszlopban az állófázis porózus mátrixból áll, a mobil fázis pedig a puffer, amely a mátrixgyöngyök között áramlik. A gyöngyöknek meghatározott pórusmérettartománya van, amelyet frakcionálási tartománynak nevezünk. Azok a molekulák és komplexek, amelyek túl nagyok ahhoz, hogy belépjenek a pórusokba, a mozgófázisban maradnak, és a puffer áramlásával mozognak az oszlopon keresztül. A kisebb molekulák és komplexek, amelyek képesek bejutni a pórusokba, belépnek az állófázisba, és a gyöngyök pórusain keresztül hosszabb úton haladnak át a gélszűrő oszlopon.

Minden olyan molekula vagy komplex, amely egy adott gélszűrő kromatográfiás oszlop frakcionálási tartománya felett van, gyorsabban halad át az oszlopon, mint bármely olyan molekula, amely be tud jutni az állófázisba. Ezért a mintában lévő bármely összetevő, amely a frakcionálási tartomány felett van, előbb eluálódik (az üres térfogatban), mint bármi, ami a frakcionálási tartományban van. Azt a minimális méretet, amely a mozgófázisban marad, és nem jut be az állófázisba, kizárási határnak nevezzük. A Bio-Rad három nagyságrendben, 100 daltontól 100 000 daltonig (100 kDa) terjedő kizárási határértékkel rendelkező gélszűrési kromatográfiás közegeket és oszlopokat kínál.

Az állófázisba kerülni képes molekulák és komplexek méretüknek megfelelően frakcionálódnak. A kisebb molekulák mélyen a pórusokba vándorolnak, és jobban késleltetve lesznek, mint a nagyobb molekulák, amelyek nem jutnak be olyan könnyen a pórusokba, és így gyorsabban eluálódnak az oszlopról. Ez a pórusvándorlásbeli különbség a komponensek méret szerinti frakcionálásához vezet, ahol a legnagyobbak eluálódnak először.

A sótalanításra, puffercserére és kis molekulák, például nukleotidok eltávolítására tervezett gélszűrő kromatográfiás oszlopokon a sók és a kis vegyületek könnyen belépnek a pórusokba, késleltetve vannak, és lassabban vándorolnak az oszlopon, mint a nagyobb fehérjék vagy nukleinsavak. Ezért a mintában lévő érdekes komponensek előbb eluálódnak, mint a sók, nukleotidok stb. Az ilyen mechanizmust alkalmazó DNS-tisztító készletek gyakran tartalmaznak gélszűrős spinoszlopokat.

A felbontást, amelyet itt a méretfrakciók közötti határok élességeként határozunk meg, a gyöngyök mérete és számos más tényező határozza meg. A kisebb gyöngyméret általában nagyobb felbontást eredményez egy gélszűréses kromatográfiás oszlopon. A kompakt molekulák gyorsabban diffundálnak az állófázison keresztül, mint a lineáris molekulák. A méretkizárást, a frakcionálási tartományt és az elúciós sebességet befolyásolja a puffer összetétele, az ionerősség és a pH. Összetett fehérjekeverékek frakcionálásához az elúciós időket és a méretkizárási határokat esetleg empirikusan kell meghatározni.

Gélszűréses kromatográfiás hordozó

A gélszűréses kromatográfiás hordozóval szemben fontos kritérium, hogy a hordozó inert legyen, és a mintában vagy a pufferben semmi ne kötődjön a hordozóhoz. További szempont, hogy milyen típusú gélszűrő oszlopot használnak, és hogy azt nyomás alatti kromatográfiás rendszerben, vagy gravitációs áramlású vagy spin oszlopokban használják. Ha nyomás alatti kromatográfiás rendszert használnak, mind az oszlopnak, mind a közegnek el kell viselnie az alkalmazott nyomást és áramlási sebességet.

A gélszűréses kromatográfiához gyakran használt közegek agaróz vagy poliakrilamid gyöngyökön, dextrózon alapulnak gravitációs vagy alacsony nyomású rendszereknél, és polimer gyantákon a közepes nyomású rendszereknél. A közeg kiválasztása az elválasztandó komponensek tulajdonságaitól és egyéb kísérleti tényezőktől függ. A következők általános megfontolások a gélszűréses kromatográfiás közeg kiválasztásakor:

• Frakcionálási tartomány
• Méretkizárási határ
• Működési nyomás
• Áramlási sebesség
• Minta viszkozitása
• pH tartomány
• Autoklávozhatóság
• Vízzel keverhető szerves oldószerek tolerálása; egyes minták jobban oldódhatnak víz-szerves keverékben
• Tolerancia mosószerekkel, kaotróp szerekkel, formamiddal stb. szemben.
• Működési hőmérséklet

A minták típusa, a közeg kiválasztása és a kromatográfiás rendszer beállítása határozza meg, hogy mely paraméterek a legfontosabbak egy adott tisztítási alkalmazáshoz.