EzColocalization: EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms

Overview of EzColocalization workflow

Az EzColocalization munkafolyamata négy modulra oszlik, mindegyiknek saját lapja van a felhasználói felületen. A lapok a következők: (i) “Bemenetek”, ahol a képek, maszkok vagy érdeklődési régiók (ROI) listái kerülnek kiválasztásra és összehangolásra; (ii) “Cell Filters”, ahol a sejtek fizikai jellemzők és jelintenzitás alapján választhatók ki; (iii) “Visualization”, ahol hőtérképek, szórásdiagramok és metrikus mátrixok (lásd alább) készülnek; és (iv) “Analysis”, ahol a kolokalizációs metrikák és kimenetek kerülnek kiválasztásra. Nem kell minden modult és egy modulon belül nem kell minden folyamatot használni. Néhány lapon van egy “Előnézet” gomb egy adott modul futtatására az “Elemzés” gomb helyett, amely az összes kiválasztott folyamatot futtatja az összes modulban.

Bemenetek

A “Bemenetek” lapon (1A. ábra) kiválasztott képfájloknak kell lenniük: (i) monokromatikusak (azaz nem RGB vagy CMYK formátumúak); (ii) 8 bites, 16 bites vagy 32 bites; és (iii) olyan formátumúak, mint például a TIFF, amely megőrzi az eredeti képpont intenzitásértékeket. A nagyméretű képeket a fájlátvitelhez veszteségmentes formátummal (pl. ZIP vagy LZW) lehet tömöríteni, majd az elemzésekhez dekompresszálni. A képeken kívül az EzColocalization képes maszkokat és ROI-listákat is elfogadni a sejtek azonosításához (lásd alább). Ha minden csatornához több kép tartozik, a képeket a hatékonyabb elemzés érdekében a “Stack” menüben kell egymásra helyezni (további részletekért lásd az ImageJ útmutatót24). A veremben lévő képek lehetnek különböző látómezők vagy idősorozatok, de az egyes csatornáknak ugyanazokkal a méretekkel, nagyítással és képsorrenddel kell rendelkezniük. A bemeneti lapon lehetőség van a jelintenzitás küszöbértékeinek beállítására és a különböző csatornákból származó, rosszul egymáshoz igazított képek összehangolására is (1B. ábra és Kiegészítő információk). A kolokalizációs elemzéshez megfelelő képek készítésére vonatkozó ajánlásokat a Kiegészítő információk tartalmazzák. Megjegyzés: az igazítás azon a feltételezésen alapul, hogy megfelelő küszöbértéket lehet választani a jelintenzitáshoz a sejteken belüli és kívüli pixelek megkülönböztetésére; ha a küszöbérték a sejten kívüli területeket vagy csak egy korlátozott területet foglal magában a sejten belül, akkor az igazítás nem biztos, hogy megfelelően működik. Emiatt minden összehangolást vizuálisan ellenőrizni kell a ROI-k vizsgálatával, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a megfelelő sejtterületeket választottuk ki.

AzEzColocalization elsősorban egy “sejtazonosító” csatorna és két vagy három “riporter” csatorna képeihez készült. Működhet azonban más bemeneti kombinációkkal is (S1 táblázat). A sejtazonosító csatorna az egyes sejtek azonosítására, és következésképpen az intracelluláris és extracelluláris pixelek megkülönböztetésére szolgál. A sejtazonosító csatorna bármilyen típusú kép lehet, amely lehetővé teszi a sejthatárok azonosítását, beleértve a következőket: fénymikroszkópos képek (pl. fáziskontraszt25,26 és fényes mező), a sejtmembránt vagy az egész citoplazmát jelölő riporterrel készült képek (pl. Cy5, 1B. ábra), valamint a sejteket körvonalazó extracelluláris festékkel készült képek. A differenciális interferencia kontraszt (DIC) képek olyan árnyékokat hoznak létre, amelyek megnehezítik a sejtek küszöbérték módszerekkel történő automatikus kiválasztását27; ezért a DIC képek esetében azt javasoljuk, hogy a ROI-kat az ImageJ “kiválasztási eszközeivel” hozzuk létre a sejtterületek kézi körvonalazására, majd a “Hozzáadás a kezelőhöz” (az “Edit” menü “Selection” almenüjében) választásával adjuk hozzá egy listához. Miután egy képen az összes érdekes sejt ROI-ja ki lett jelölve, az ImageJ “Clear Outside” és “Autothreshold” funkcióinak használatával bináris maszk hozható létre.

Cellafilterek

A “Cell Filters” fül segít a sejtek kiválasztásában a képeken (2A ábra) és az intracelluláris és extracelluláris pixelek megkülönböztetésében. A sejtek azonosítása a következők szerint történik: (i) az ImageJ küszöbérték algoritmusai24 valamelyikének kiválasztásával, vagy a küszöbértékek kézi kiválasztásával (ami az “Inputs” lapon található legördülő listából a “*Manual*” kiválasztásával és a “Show threshold(s)” gomb megnyomásával történik), a sejtazonosító csatornában lévő sejteknek megfelelő régiók azonosításához (ábra. 2B); ii) vízválasztó szegmentáció alkalmazása a sejtazonosító csatorna képein az érintkező objektumok elkülönítésére (opcionális) (2B. ábra); iii) objektumok kiválasztása a sejtazonosító csatorna képeiből fizikai paraméterek (2C. ábra) és jelintenzitás (2D. ábra) alapján. Az EzColocalization megpróbálja automatikusan felismerni, hogy a bemeneti képek sötét vagy világos hátterűek-e a ferdeség segítségével. Feltételezve, hogy a háttérben több pixel van, mint a sejtekben, a pozitív ferdeségű kép sötét hátteret, a negatív ferdeségű pedig világos hátteret jelez. A felhasználók manuálisan is kiválaszthatják, hogy a bemeneti képek sötét vagy világos háttérrel rendelkeznek-e, a “Beállítások” menü “Paraméterek…” opcióiban. Azok a cellák, amelyek csak részben vannak egy képen belül, és ezért félrevezető értékeket szolgáltathatnak, automatikusan eltávolításra kerülnek az elemzésekből.

AzEzColocalization egy opcionális “Pre-watershed filter” és nyolc opcionális post-watershed filterrel rendelkezik (továbbiak kiválasztására is lehetőség van). A vízgyűjtő szegmentálás segíthet az osztódó és az érintkező sejtek elkülönítésében28 , de a nagy objektumokat, például az extracelluláris anyag aggregátumait is képes kisebb, a sejtekkel azonos méretű fragmentumokra osztani. Ez utóbbiak elkerülése érdekében a Pre-watershed szűrővel a nagy területű objektumok kizárhatók az elemzésből. A Cell Filters (Sejtszűrők) lapon található Preview (Előnézet) gomb segítségével a felhasználók láthatják, hogy az összes szűrő minimális és maximális határainak beállításakor mely objektumok lesznek kiválasztva az aktuális képen. A vízgyűjtő utáni cellaszűrők paramétereinek két osztálya létezik (S2. táblázat): (i) fizikai paraméterek, amelyek a sejtazonosító csatorna mérésein alapulnak; és (ii) jelintenzitás-paraméterek a riportercsatornákból. A fizikai paraméterek minden csatornára vonatkoznak, míg a jelintenzitási paraméterek csak arra a riportercsatornára vonatkoznak, amelyhez kiválasztásra kerültek (mivel a riporterek nagyon eltérő jelszintekkel rendelkezhetnek). Az ImageJ-ben előre meghatározott opciók alapján történő szűrésen kívül az EzColocalization rendelkezik szűrőkkel a “MeanBgndRatio” vagy a “MedianBgndRatio” számára, amelyeket úgy számítanak ki, hogy az objektumon belüli pixelek átlagos vagy medián jelintenzitását elosztják az extracelluláris pixelek megfelelő átlagos vagy medián jelintenzitásával.

Vizualizáció

A “Visualizáció” lapon a jeleket vagy metrikákat a sejtekben megjelenítik, mint: (i) “hőtérképek”; (ii) szórásdiagramok; és (iii) “metrikus mátrixok” (3A ábra).

A hőtérképek pszeudoszínű képek, amelyek a riporterjelek relatív nagyságát mutatják (3B ábra). Ezeket normalizálással és átméretezéssel hozzuk létre úgy, hogy a minimális és maximális pixelértékek 0, illetve 255 legyenek minden egyes cellában, képen vagy veremben. A hőtérképek színezésére nyolc lehetőség van, és az egyes színek intenzitásértékei az ImageJ “Image” menüjének “Color” almenüjén belül a “Show LUT” funkcióval (az ImageJ “Image” menüjének “Color” almenüjében) érhetők el. A cellás hőtérképek alkalmasak annak meghatározására, hogy az egyes riporterek hol fordulnak elő a legnagyobb intenzitással a sejtekben. A képi hőtérképek megmutathatják, ha egy látómezőn belül a különböző sejtek jelentősen eltérő intenzitásúak, ami biológiai heterogenitásra vagy a jelölés egyenetlenségére utalhat. A halom hőtérképek megmutatják, ha a különböző képeken lévő sejtek jelintenzitása lényegesen eltérő, ami jelezheti a jelölés vagy a mérések egyenetlenségét a tárgylemezen (pl. a fotobleaching miatt) vagy a jel időbeli változását (ha a halom egy idősorozat). Megjegyzés: a hőtérkép megjelenését a fényerő és a kontraszt beállításai befolyásolják.

A szórásdiagramok a két vagy három riportercsatorna jelintenzitása közötti kapcsolatot mutatják az egyes sejtek és képek esetében (3C. ábra). Ez a kapcsolat fontos a megfelelő kolokalizációs metrika kiválasztásában (Kiegészítő információk). A szórásdiagramok a lokalizációs mintázatok heterogenitását is feltárhatják8 , ami szükségessé teheti a háttérpixelek eltávolítását vagy a különböző sejttípusok külön elemzését.

A metrikus mátrixok áttekintést nyújtanak a lokalizációs mintázatokról azáltal, hogy egy kolokalizációs metrika számított értékeit mutatják számos küszöbérték-kombinációra. A threshold overlap score (TOS) metrikus mátrixai hasznosnak bizonyultak két riportercsatorna lokalizációs mintázatainak elemzéséhez8,15 (3D ábra). A teljesség kedvéért az EzColocalization lehetőséget biztosít arra, hogy két riportercsatornára metrikus mátrixokat számítson ki öt másik metrika segítségével: threshold overlap score logaritmikus skálázással8, Pearson korrelációs együttható (PCC), Manders kolokalizációs együtthatók (M1 és M2), Spearman rangkorrelációs együttható (SRCC) és intenzitás korrelációs hányados (ICQ)8,15. A három csatorna kolokalizációja szintén mérhető az ICQ, a Manders-féle kolokalizációs együtthatók és a TOS29 segítségével (Kiegészítő információk).

A küszöbértékeket minden metrika esetében a jelintenzitás pixeleinek felső percentiliseként (FT) mértük8,15. Például FT = 0,1 a legmagasabb jelet mutató pixelek 10%-át jelenti. A metrikus mátrixok esetében az FT-t a küszöbérték-kombinációk lépésméretének meghatározására is használják. Vagyis az FT = 0,1 a legmagasabb jelű pixelek 10%-ának, 20%-ának, …, és 100%-ának küszöbértékeit is kiválasztja. Ha FT nem oszlik egyenletesen 100-ra, akkor a fennmaradó százalék az utolsó lépésméret. A küszöbértéket nem igénylő metrikák (pl. PCC, SRCC és ICQ) esetében az értékek kiszámítása úgy történik, hogy feltételezzük, hogy csak a küszöbértékek feletti pixelek léteznek. A metrikus mátrix ablakban lehetőség van az eredmények szövegként vagy képként történő mentésére, az FT vagy a metrika típusának megváltoztatására, az egyes cellák metrikus értékeinek listaként történő megtekintésére, valamint a metrika átlagának, mediánjának vagy móduszának kiszámítására az egyes küszöbérték-kombinációkhoz. A “Proc” (feldolgozott) és a “Raw” (nyers) gomb határozza meg, hogy a “List”, “Copy” (Másolás) vagy “Save…” (Mentés…) gombokkal megjelenített, másolt vagy mentett adatok listája a minta átlagértéke az egyes küszöbérték-kombinációkhoz (pl. mediánérték) vagy a minta minden egyes cellájának összes értéke az összes küszöbérték-kombinációhoz.

Analysis

Az “Analysis” lapon három allap található (“Analysis Metrics”, “Metrics Info” és “Custom”). Az “Analysis Metrics” alfül hat metrikát tartalmaz a kolokalizáció mérésére két riporter esetében (4A. ábra) és három metrikát három riporter esetében (lásd az előző részt). A felhasználók választhatnak küszöbértéket vagy küszöbérték nélküli értéket a PCC, SRCC és ICQ esetében. A TOS és Manders kolokalizációs együtthatók kiszámításához küszöbértéket kell megadni. A Metrics Info altab tartalmazza az Analysis Metrics altabban használt metrikákkal kapcsolatos információkat és forrásokat (további részletek a Kiegészítő információkban). A küszöbértékeket Costes módszerével30 vagy manuálisan lehet kiválasztani. Az Egyéni alfülön (további információkért lásd a Kiegészítő információkban) a felhasználók saját kódot írhatnak JavaTM nyelven a képek elemzéséhez (megjegyzés: a megadott példa a PCC kiszámítására vonatkozik) (4B. ábra). A “Compile” gomb teszteli a kódot, és létrehoz egy ideiglenes fájlt a Java ideiglenes könyvtárában, és megjeleníti a fordítás eredményét egy “Succeeded” vagy “Failed” címkével. Sikeres fordítás esetén a lefordított egyéni kód újra beolvasásra kerül a memóriába, és a kiválasztott cellákra alkalmazásra kerül.

Az egyes elemzések kimenete egy táblázat, amely minden egyes cellához megadja a képet és egy azonosító számot (4C. ábra), és minden egyes cellához értékeket ad meg: (i) a kiválasztott metrika; (ii) fizikai paraméterek; és (iii) átlagos jelintenzitás minden egyes csatornára (ha kiválasztásra került). Megjegyzés: A kimeneti táblázatban a “NaN” jelzi az érték kiszámításának sikertelenségét. A felhasználók létrehozhatnak továbbá összefoglaló ablakokat (a kiválasztott metrika cellaszámával, átlagával, mediánjával és szórásával) (4D. ábra), a metrikaértékek hisztogramjait (4E. ábra), bináris maszkképeket, valamint a ROI-kezelőben az egyes cellák pozícióját és számát az egyes képeken ábrázoló ROI-k listáját. A ROI-listák és a bináris maszkképek elmenthetők ugyanazon sejtek ismételt elemzéséhez.

Az EzColocalization alkalmazásai

Az EzColocalization modulárisan használható, hogy megkönnyítse az elemzések testreszabását a legkülönbözőbb kísérletekhez és kutatói igényekhez. Ez a rész az EzColocalization konkrét eszközeinek bemutatására összpontosít, amelyekkel valós problémákat lehet megoldani különböző képhalmazokban.

Az EzColocalization első alkalmazásában a Cell Image Library (CIL:8773, 8775-8788, amelyek Dieter Brandner és Ginger Withers nevéhez fűződnek) patkány hippokampusz neuronjairól készült képeket használjuk fel: (i) a riportercsatorna használata a sejtek azonosításához, ha egy kísérlet nem rendelkezik külön nem riporterképekkel a sejtek azonosításához; (ii) sejtszűrők a sejtek kiválasztásához; és (iii) vizualizációs eszközök a metrikák kiválasztásához. Az elemzés munkafolyamata az 5A. ábrán látható. Az első lépésben két riporterkép-halmazt hoztunk létre: az egyik halmazt olyan képekkel, amelyeken F-aktin van jelölve (egy rhodaminhoz konjugált falloidin peptid segítségével); és a második halmazt olyan képekkel, amelyeken tubulin van jelölve (egy Alexa 488-hoz konjugált antitest segítségével) (5B. ábra). Az F-aktin és a tubulin kölcsönhatása fontos a neuronok növekedése és migrációja szempontjából31,32. Az F-aktin képeket a sejtek azonosítására használtuk, mivel minden sejtben jelen van, és megmutatja a sejthatárokat8. Az F-aktin képekből úgy választottuk ki az egyes sejteket, hogy a sejtek azonosítására küszöbértéket alkalmaztunk24 , a sejttörmelék eltávolítására pedig cellaszűrőt használtunk (megjegyzés: paraméterértékek az 5A. ábrán).

A sejtek kiválasztása után a riporterjelek intenzitását celluláris hőtérképek és szórásdiagramok segítségével vizsgáltuk. Azt találtuk, hogy a riporterek nem kolokalizálódtak magas jelszinteken, és a jelintenzitások között összetett kapcsolat állt fenn (5C,D ábra). Ez utóbbi miatt a lokalizációt a Manders-féle M1 és M2 és TOS segítségével számszerűsítettük (Kiegészítő információk). Az M1 és M2 értékét a Costes-módszerrel kiválasztott küszöbértékekkel értékeltük az 5B. ábrán vázolt sejtre, és az értékek 0,289, illetve 0,995 voltak. Ezeket az értékeket általában úgy értelmezik, hogy a tubulin magas kolokalizációval rendelkezik az F-aktinnal, az F-aktin pedig alacsony kolokalizációval a tubulinnal. A TOS-értékeket a TOS-értékek mediánjait tartalmazó metrikus mátrix létrehozásával értékeltük. A mátrix a tubulin és az F-aktin jelintenzitásainak különböző küszöbértékeinél kolokalizációt, antikolokalizációt és nem-kolokalizációt mutatott (5E. ábra). Azokon a helyeken a sejtekben, ahol az F-aktin és a tubulin a legnagyobb intenzitású jellel rendelkezik (a pixelek felső 10%-a minden csatorna esetében), a TOS-érték mediánja -0,36 (n = 20). Ez a negatív érték antikolokalizációra utal, ami összhangban van a hőtérképek és szórásdiagramok alapján kapott benyomással és más jelentésekkel8.

A második alkalmazásban mitózisban lévő Saccharomyces cerevisiae-ről készült képeket nyertünk a Cell Image Library33-ból, hogy bemutassuk: (i) a sejtek azonosítása kézzel rajzolt körvonalak segítségével (olyan kísérletekhez, ahol a sejtek azonosításának automatizált módszerei nem alkalmazhatók); és (ii) a képek összehangolása. A riporter bemeneti kép egy vad típusú törzsből (“kontroll”; CIL: 13871) származó kép volt, amely rendelkezik a TEM1-et az orsópólus testére rakodó BFA1 fehérjével, valamint egy BFA1 fehérje nélküli törzsből (∆bfa1 deléciós mutáns; CIL: 13870) származó kép. Ezeken a riporterképeken a sejtek GFP-hez fuzionált TEM1 fehérjét expresszálták, a DNS-t pedig DAPI-val (4′, 6-diamidino-2-fenilindol) jelölték. A TEM1 a mitózis során az orsópólus testekhez lokalizálódik, és szerepet játszik a mitózisból való kilépés kiváltásában33. A munkafolyamatot a 6A. ábra mutatja. Ebben az alkalmazásban a ROI-kat kézzel rajzoltuk a sejtek köré az ImageJ “Freehand” kijelölő eszközével a DIC-képeken. A sejtterületek kijelölésére használt bináris maszkokat a ROI-k kijelölésével és az ImageJ24 “Clear Outside”, majd “Auto Threshold” funkciójának használatával hoztuk létre (6B. ábra). A sejtterületeket a sejtek azonosítására és a DIC-képek és a riportercsatornák közötti összehangolás korrigálására használtuk a “Default” küszöbérték algoritmus segítségével (6C. ábra). Ezt a sejtazonosítást és képigazítást követően a képek készen álltak az előző példában leírtak szerinti vizualizációra és elemzésre.

A harmadik alkalmazásban a Broad Bioimage Benchmark Collectionből (BBBC012v1, M14)34 nyert, teljes kifejlett Caenorhabditis elegansról készült képeket használtuk annak bemutatására, hogy: (i) az EzColocalization képes a kolokalizáció elemzésére egész organizmusokban; és (ii) a “sejt” szűrők képesek az egyes organizmusok kiválasztására a riporterjel intenzitása alapján. A példában szereplő képek ugyanabból az adatkészletből származnak, amelyet a TOS-t leíró tanulmányunkban használtunk (de ezek nem ugyanazok a képek)8 . A munkafolyamatot a 7A. ábra mutatja. Az egyes C. elegans egyedek körvonalait az ImageJ programban rajzoltuk ki a fényes térbeli képekre, hogy ROI-ket hozzunk létre, majd a ROI-ket hozzáadtuk a ROI-kezelőhöz a “sejt” azonosításához. Az elülső bélben a clec-60 promóterrel kifejezett GFP volt az 1-es riporter, a myo-2 promóterrel kifejezett mCherry pedig a garatban, amely az elülső bél melletti szerv35 , a 2-es riporter. A fizikai paraméterekre vonatkozó sejtszűrőkre nem volt szükség, mivel eleve csak a C. elegansnak megfelelőnek ítélt objektumok köré rajzoltak körvonalakat. A jelintenzitásra vonatkozó sejtszűrőkre azonban azért volt szükség, mert néhány C. elegan esetében a GFP-jel alacsony volt, valószínűleg a transzgének elnémítása36,37 miatt (7B. ábra). A későbbi vizualizáció és elemzés az első alkalmazásban leírtak szerint végezhető el.

A negyedik alkalmazásban három riportercsatorna kolokalizációjának elemzését mutatjuk be. A munkafolyamat ugyanaz volt, mint a két riportercsatorna esetében, kivéve, hogy a “Beállítások” főmenüben először a “3 riportercsatornát” kellett kiválasztani (8A. ábra). A képeket a Broad Bioimage Benchmark Collection (BBBC025, Version 1, Image set: 37983, image: p23_s9) U2OS csontráksejtekből (n = 66)38 nyertük. A három riporterképen a DNS-t, az endoplazmatikus retikulumot (ER) és a mitokondriumokat Hoechst 33342-vel, concanavalin A/Alexa Fluor488 konjugátummal, illetve MitoTracker Deep Reddel festették (felső sor, 8B ábra). A sejtek azonosítását a plazmamembrán búzacsíra agglutinin (WGA)/Alexa Fluor 555 konjugátummal jelölt képével végeztük (bal felső sarok, 8B. ábra). Megjegyzés: a képen a Golgi-apparátus és az F-aktin hálózat is fel volt jelölve38. A plazmamembránt az ImageJ poligon-kiválasztó eszközével követtük nyomon, hogy ROI-kat hozzunk létre az egyes sejtekhez, és a ROI-kat tartalmazó ROI-kezelőt választottuk ki a sejtek azonosításához.

A lokalizációs mintázatokat ugyanúgy ábrázoltuk, mint a két riporter esetében, kivéve, hogy: (i) a riporterek esetében kettő helyett három hőtérkép-készlet van (alsó sor, 8B ábra); és (ii) a szórásdiagramok és a metrikus mátrixok három dimenzióban vannak (8C-F ábra). A Vizualizáció lapon és az Elemzés lapon (8G. ábra) lehetőség van a három riporter kolokalizációjának mérésére ICQ, TOS vagy Manders M1, M2 és M3 metrikák segítségével. A három metrika közül a TOS-t találtuk a legkönnyebben értelmezhetőnek. A TOS egyetlen értékkel méri mindhárom riporterjel kolokalizációját, és egyértelműen kimutatta, hogy a mag, a mitokondrium és az ER riporterjelek alacsony küszöbértékeknél átfedésben vannak (azaz magas FT-értékeknél kolokalizáció van; piros szín a 8E. ábrán), és magas küszöbértékeknél nem fedik egymást (azaz alacsony FT-értékeknél antikolokalizáció van; kék szín a 8E. ábrán). Ezek a megfigyelések összhangban vannak azzal, hogy a sejtmag, a mitokondriumok és az ER organellumok az ismert fizikai kölcsönhatások miatt átfedésben vannak a széleiken (ahol a riportereik jele jellemzően alacsonyabb), de nem a központjukban (ahol a riportereik jele jellemzően magasabb), mivel ezek a sejtekben különálló struktúrák39,40,41.

.