Evolutionary analysis of gyrA gene from Neisseria meningitidis bacterial strains of clonal complex 4821 collected in China between 1978 and 2016

Evolutionary analysis of 77 gyrA nucleotide sequences from CC4821 N.meningitidis törzsekből

A CC4821 N.meningitidis törzsek hetvenhét de novo gyrA-szekvenciáját elemeztük 149 nyilvánosan elérhető gyrA-szekvencia kontextusában (az 1. kiegészítő táblázatban szerepel). Az így kapott 226 gyrA-nukleotidszekvenciából álló adatkészletből szomszédkötéses filogenetikai fát építettünk (1. ábra). Hasonló fát kaptunk a maximális valószínűség (ML) módszerével is (1. kiegészítő ábra). A nukleotidszekvenciák szignifikánsan eltérőek voltak, a teljes p-távolság 0,045 volt (1. táblázat). A fa áttekintése azt mutatta, hogy a CC4821 N.meningitidis törzsekből származó szekvenciák (az 1. ábrán piros színnel jelölve) a fa teljes hosszában megtalálhatóak, ami azt mutatja, hogy a gyrA gén viszonylag eltérő volt ezeken a törzseken belül.

Neisseria törzsek 226 gyrA génszekvenciájának szomszédsági fája. A törzsek neve a következőképpen van feltüntetve: fajnév-GB azonosító-törzs azonosító-ST-CC-szerocsoport-gyűjtési ország-gyűjtési év-gyűjtési év-CIP rezisztenciafenotípus. A hiányzó információkat üres hely jelzi. Például: N.meningitidis-AM889136.1-alpha14-ST53-CC53-cnl-Németország-1999 S; Eikenella corrodens-CP034670.1-KCOM3110—-Dél-Korea-2017. A CC4821 N.meningitidis törzsekből származó szekvencia nevei piros betűtípussal vannak jelölve. Az ebben a tanulmányban generált 77 szekvencia aláhúzva. A 9 referencia törzs szekvenciáit fekete pont jelzi. A > 70%-os Bootstrap-értékek jelölve vannak. A < 70%-os Bootstrap-értékek szükség esetén zárójelben szerepelnek. Az ebben a tanulmányban azonosított 9 genetikai csoportot zárójeles függőleges vonalak jelzik. A CIP-rezisztencia fenotípust R a rezisztenciát, S az érzékenységet és I az intermedier rezisztencia fenotípust jelöli

A 226 elemzett szekvencia közül a szekvenciák közel 62%-a (140) a fa csúcsán található, szignifikáns bootstrap érték nélkül (1. ábra). Ezek a szekvenciák rendkívül homogének voltak, a p-távolság 0,003 volt (1. táblázat). A fennmaradó 86 szekvencia a fa tetején csoportosuló szekvenciákhoz viszonyítva 0,066-os p-távolsággal nagyobb eltérést mutatott. A 86 szekvenciára vonatkozó legtöbb csomópont bootstrap-értéke > 70% volt. Ezenkívül a 86 szekvenciából álló csoporton belüli p-távolság 0,09 volt, ami azt mutatja, hogy ezek a szekvenciák nagymértékben eltérnek egymástól. Mivel a fa főbb csomópontjainak bootstrap-értéke > 80% volt, úgy döntöttünk, hogy a szekvenciákat önkényesen 9 különböző genetikai csoportba soroljuk (1. ábra; 1. táblázat). Ez a 9 csoport az ML-fában is megtalálható volt (1. kiegészítő ábra). A CC4821 törzsekből származó gyrA-szekvenciákat e genetikai csoportok közül 6-ban találtuk meg, nevezetesen az 1., 2., 3., 5., 6. és 8. csoportban.

Az 1. csoport 2 szekvenciából állt: N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 és N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009. Ezt a csoportot 100%-os bootstrap alátámasztotta, ami arra utal, hogy ez a 2 szekvencia nagyon különbözik a többi szekvenciától. A szekvenciák 7 aminóváltozást osztottak meg (1. táblázat, 2. kiegészítő táblázat). A N.subflava-CP031251.1-M18660—-2009 szekvenciának megfelelő hosszú ág azonban azt sugallta, hogy ez a szekvencia is jelentősen eltér a N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005-től, és ezt a 2 szekvencia közötti 0,06-os p-távolság is megerősítette (1. táblázat).

A 2. csoport 2 szekvenciából állt, amelyek a N.meningitidisből származnak.meningitidis törzsekből állt, amelyeket 2007-ben és 2011-ben gyűjtöttek Kínában, Gansu és Guangxi tartományban, nevezetesen N.meningitidis-KF733178-G1-ST5636-UA-B-China-2007-R és N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011.

A 3. csoport egyetlen szekvenciából állt, nevezetesen az N.meningitidis-MK930402-231003-ST12300-CC4821-B-China-2009. Az e szekvenciának megfelelő csomópontot 80%-os bootstrap-értékkel támasztották alá. Továbbá, az e szekvencia és a többi elemzett szekvencia közötti legalacsonyabb p-távolság páronkénti értéke 0,032 volt, ami azt mutatja, hogy ez a szekvencia jelentősen eltér a többi elemzett szekvenciához képest (1. táblázat).

Az 5. csoport 26 szekvenciából állt, főként N.meningitidisből, köztük 9 CC4821-ből. Egy 7 szekvenciából álló, 100%-os bootstrappal támogatott alcsoportban 5 N.lactamica szekvencia szerepelt. Érdekes módon az N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 100%-os bootstrappal és hosszú elágazással N.lactamica szekvenciákkal klasztereződött.

A 6. csoport 27 szekvenciából állt, amelyek N.meningitidisből származnak.meningitidisből (8 a CC4821-ből) és 1 N. cinerea szekvenciából, nevezetesen a N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 szekvenciából, amely osztozott egy csomóponton az N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R szekvenciával. A N.cinerea szekvencia azonban hosszú elágazást mutatott, ami jelentős eltérésre utal a N.meningitidis szekvenciához képest. A rendelkezésre álló adatok alapján úgy tűnt, hogy a 6. csoport szekvenciái a CIP-re rezisztens törzsekből származnak. Azonban ezek a törzsek nem mutattak ki közös aminosav-szubsztitúciót, ami arra utal, hogy nem volt közös marker e törzsek rezisztenciafenotípusának (2. kiegészítő táblázat).

A 8. csoport tartalmazta a legtöbb, ebben a jelentésben elemzett N.meningitidis-szekvenciát (64%). A törzseket az elmúlt 88 évben gyűjtötték 4 kontinens 13 különböző országából. A jelentős időbeli és földrajzi elterjedtség ellenére ezek a szekvenciák nagymértékben konzerváltak, a p-távolság 0,003 volt. Ráadásul ezek a szekvenciák 68 ST, 24 CC és 9 szerocsoportba tartozó törzsből származtak, beleértve a 053442-es referencia törzset is. Összességében ezek a megfigyelések azt mutatták, hogy a gyrA gén erősen konzervált a legtöbb N.meningitidis törzs között az eltérő genetikai jellemzők, földrajzi elhelyezkedés vagy gyűjtési idő ellenére.

A GyrA fehérjén belüli divergencia elemzése

A GyrA fehérjén belüli aminosav-divergenciát 129 egyedi szekvencia között elemeztük (2. kiegészítő táblázat). Kétszázötvenhét eltérő pozíciót azonosítottak az igazításban szereplő 931 aminosav között (2. ábra). Bár ezek a helyek az egész fehérjében megtalálhatóak voltak, az eltérések eloszlása nem tűnt véletlenszerűnek. Valójában két régió volt erősen konzervált, az 530 és 620 közötti pozíció, valamint egy kisebb régió a 300 és 330 közötti pozíció között. Az E.coli fehérje szerint az első régió az aminoterminális domén végének és a karboxi-terminális domén kezdetének felel meg. A második régió a fehérje toronydoménjének felel meg a 3D modellszerkezet alapján (2. ábra).

A GyrA fehérje között 129 egyedi szekvencia alapján mért aminosavdivergencia. A 932 aminosav hosszúságú illesztésen belüli pozíciókat az X tengelyen jelöljük. Az Y tengelyen (bal oldalon) az adott divergens pozíciót tartalmazó szekvenciák százalékos aránya látható. Például a szekvenciák 58%-a tartalmaz mutációt a 91. pozícióban. A divergencia-diagramot a 2. kiegészítő táblázatban szereplő aminosav-különbségtáblázatból generáltuk. Az illesztés 10 hézagot tartalmaz, és a hézagokat tartalmazó szekvenciák számát a jobb oldali tengelyen fekete négyzet jelzi. Az E.coli GyrA fehérje szerkezeti és funkcionális doméneket tartalmazó térképe az összehasonlítás érdekében alul látható. A térképet a következő hivatkozások alapján készítettük. Az E.coli és a N.meningitidis 053442 referencia törzs (GB-ID CP000381) GyrA fehérje szekvenciáját összehasonlítottuk (4. kiegészítő táblázat). Az E.coli ismert CIP-rezisztens helyei láthatóak, a N.meningitidis megfelelő pozícióit pedig kék vonal jelzi. Érdemes megjegyezni, hogy az E.coliban jelentett 8 rezisztens hely közül csak a 83. és 87. pozíciók térnek el az N.meningitidisben (91. és 95. helyek)

A 257 eltérő pozíció közül egyik sem volt közös a CC4821 törzsek összes elemzett gyrA-szekvenciájában. Öt hely (91, 417, 665, 210 és 288) erősen divergens volt, a 129 szekvencia 40%-a vagy annál több mutálódott ezeken a pozíciókban. Például a 129 szekvencia 48%-a mutált maradékot tartalmazott a 417-es pozícióban (2. ábra). Úgy tűnt, hogy egy pozíció (91) kapcsolódik a CIP-rezisztenciához, minden olyan törzs, amely nem volt érzékeny a CIP-re, mutálódott ezen a pozícióban, és vagy egy I, vagy egy F, vagy egy V volt benne (2. kiegészítő táblázat).

Potenciális CIP-rezisztencia markerek azonosítása

A 226 elemzett szekvencia közül 174 olyan törzsből származott, amelyet CIP-rezisztencia szempontjából vizsgáltak (1. kiegészítő táblázat). A vizsgálathoz 67 törzset vizsgáltak. Mint már említettük, a CIP-re nem érzékeny (vagy rezisztens fenotípusú (R a fán), vagy köztes fenotípusú (I a fán)) törzsek mindegyike mutálódott a 91-es pozícióban. Ez azt mutatta, hogy a 91-es pozícióban lévő mutáció kapcsolódik a rezisztencia mechanizmusához. Az ebben a vizsgálatban vizsgált 67 törzs közül 49 törzs mutálódott a 91-es pozícióban, de ezek közül 23 törzs intermedier rezisztenciafenotípussal rendelkezett. Ez arra utalt, hogy más pozíciók is részt vehetnek a rezisztencia mechanizmusában. A rezisztencia további potenciális markereinek azonosítása érdekében a 226 törzset tovább elemezték az egyes mutáns pozíciókban. Az olyan változás, amely a rezisztens törzsekben megtalálható (beleértve az intermedier rezisztencia fenotípust is), de egyetlen szenzitív törzsben sem volt megtalálható, minősült. Az elemzés szigorúságának növelése érdekében azonban a csak egy törzsben talált mutációt nem vették figyelembe. Összesen 33 helyet azonosítottak (3. kiegészítő táblázat; 4. kiegészítő táblázat bal oldala). A H8N például 18 rezisztens törzsben (köztük 2 intermedier fenotípusú törzsben) volt megtalálható, de egyetlen érzékeny törzsben sem szerepelt. Mind a 226 törzset elemezték e 33 pozíció tekintetében. Ismétlem, az elemzés szigorúságának növelése érdekében a legalább egy érzékeny törzsben talált mutációt elvetették. Így a rezisztens és érzékeny törzsekben talált D95N mutációt a továbbiakban nem vettük figyelembe. Összesen 39 mutációt (néhányat ugyanazon a pozícióban, például a 91. pozícióban) elemeztünk (zöld színnel a 4. kiegészítő táblázat bal oldalán). Mutációs profilt készítettünk a 128 törzsre, amelyekben legalább egy érdekes mutáció található (3. kiegészítő táblázat). Negyvenhat különböző profilt azonosítottunk, ami azt jelenti, hogy ennek a 39 mutációnak 46 kombinációja volt az összes elemzett törzsben (a 4. kiegészítő táblázat jobb oldala). A 46 mutációs profilból tizenhat a CC4821 törzsekre vonatkozott (a 4. kiegészítő táblázat piros színű számai). Huszonhat profil olyan törzseket érintett, amelyekről ismert volt, hogy CIP-rezisztensek (a törzsek neve kék betűtípussal a 4. kiegészítő táblázatban). A 39 potenciális rezisztenciamarker közül az N103D és a T91I mutáció volt a leginkább közös a profilokban, 29, illetve 27 megjelenéssel. Érdemes azonban megjegyezni, hogy más mutációk is jól szerepeltek, mint például a H8N, I111V, E793Q és A679S 23, 21, 18 és 17 megjelenéssel. Azt is érdemes megjegyezni, hogy a rezisztens törzsek 45%-a (58 törzs a 128-ból) csak a T91I mutációt tartalmazta. Mivel a rezisztenciamarkereket eredetileg E.coliban írták le, az E.coli és a N.meningitidis 53,442 referencia törzs gyrA szekvenciái közötti összehasonlításra volt szükség ahhoz, hogy ellenőrizzük e markerek helyzetét az E.coli szekvenciájában (5. kiegészítő táblázat).

Rekombináció a gyrA génen belül a N. spp.

A filogenetikai elemzés potenciális rekombinánsokat azonosított. Különösen érdekes volt például az 1. csoport, amely a N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 és a N.subflava-CP031251.1-M18660-ra vonatkozott. E két szekvenciában 7 olyan közös maradékváltozást találtunk, amely más törzsekben nem volt megfigyelhető. Ráadásul ezek közül 5 változás 30 aminosavon belül történt (1. táblázat). Végül, az egyik törzsben megfigyelt aminosavváltozások nem voltak megfigyelhetők a másik törzsben, mint például a 740. és 750. pozíció. Mindezek a megfigyelések a 2 törzs közötti rekombinációra utaltak, amit a BootScan-elemzés is megerősített (3a. ábra). Három másik lehetséges rekombinációt is megerősített a BootScan. A 3b. ábra egy CC4821 törzs (valószínűleg N.meningitidis-MK930428-421615-ST10235-CC4821-B-China-2016 vagy N.meningitidis-CP000381.1-053442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R) és N.cinerea-LS483369.1-NCTC10294 —– közötti rekombinációt írt le. A 3c. ábra a N.lactamica-CP031253.1-M17106—– és két N.meningitidis törzs, a N.meningitidis-KJ415206.1-54-R6—– és a N.meningitidis-CP000381.1-53,442-ST4821-CC4821-C-China-2004_R közötti többszörös rekombinációs eseményeket mutatja. Végül a 3d. ábrán a N.meningitidis törzsek közötti rekombináció látható. Összességében a rekombinációs elemzés azt mutatta, hogy a Neisseria törzsek gyrA génje igen hajlamos a rekombinációra.

Potenciális rekombinációs események a Neisseria törzsek között fajon belül és belül. a. N.subflava és N.meningitidis közötti rekombináció. A BootScan-diagramot a SimPlot programban hoztuk létre N.meningitidis-MK930374-100514-ST4832-CC4821-C-China-2005 lekérdezéssel. b. Rekombináció a N.cinerea és a N.meningitidis között. BootScan-diagramot hoztunk létre a SimPlot programban N.meningitidis-KF733132-59-ST7962-CC77-NG-China-2009-R lekérdezéssel. c. Rekombináció N.lactamica és N.meningitidis között. BootScan-diagramot készítettünk a SimPlot programban N.meningitidis-MK930398-140901-ST8241-CC4821-B-China-2009 lekérdezéssel. d. N.meningitidis törzsek közötti rekombináció. BootScan-diagramot készítettünk a SimPlot programban N.meningitidis-MK930446-GX34173-ST9477-CC4821-B-China-2011 lekérdezéssel. Az a törzs, amely az előrejelzések szerint a legnagyobb mértékben járul hozzá a rekombinációs folyamathoz (gerincvonal), piros vonalként látható. A 053442 N.meningitidis referenciatörzs (GB ID CP000381) fekete vonallal van jelölve. A 053442 referenciatörzs funkcionális térképét a 2. ábrán látható E.coli funkcionális térkép alapján a fenti ábrán

látható.