Endoplazmatikus retikulum-asszociált degradáció (ERAD)

2.1 A fehérjék hajtogatási folyamata és a rosszul hajtogatott fehérjék felismerése

A sejt összes fehérjéjének és valamennyi transzmembrán fehérjéjének mintegy 30%-a az ER-ben szintetizálódik, amely a Sec61 csatornán keresztül a szekréciós útvonalba való belépés portáljaként szolgál. A transzlokáció során az újonnan szintetizált fehérje N-terminális hidrofób jelszekvenciáját egy peptidáz komplex hasítja. A ko- és poszttranszlációs módosítások, mint például a diszulfidkötések kialakulása, az N-glikoziláció kezdeti lépései és a glikofoszfatidil-inozitol (GPI) lehorgonyzása az ER-ben történik.

Az ER oxidáló környezete segíti a diszulfidkötések kialakulását, ami stabilizálja a tercier fehérjeszerkezetet és megkönnyíti a fehérjék összeépülését. A hajtogatási folyamat során a diszulfidkötések a ciszteinmaradványok szabad tiolpárjainak oxidációjával jönnek létre a fehérjediszulfid-izomerázok (PDI) által. A PDI-k ciklikusan működnek, és a kezdeti oxidáció után a diszulfidkötéseket néha a PDI és az ERp57, amely egy tiol-oxidoreduktáz, izomerizálja a fehérje helyes hajtogatásának stabilizálása érdekében . Ezzel szemben a rosszul foldozott fehérjék diszulfidkötéseinek redukciója szükséges az ERAD retrotranszlokációs lépéséhez. A PDI valóban lehetővé teszi a simian virüs-40 (SV-40) és a koleratoxin retrotranszlokációját . Az ERdj5, egy ER-oxidoreduktáz, csökkenti a diszulfidkötéseket és kölcsönhatásba lép az EDEM-mel (ER-degradációt fokozó mannozidáz-szerű fehérje), és szintén felgyorsítja az SV-40 retrotranszlokációs lépését . Az ERDJ5 szabályozza a betegséget okozó α1-antitripszin variáns (null Hong Kong) degradációját is .

A hajtogatást molekuláris chaperonok segítik a félre- és kibontakozás ellen. A chaperonszerű glikánok kötődnek az N-glikánokhoz, amelyek döntő szerepet játszanak a fehérjék hajtogatásában és lebontásában. Nyilvánvaló, hogy az N-glikoziláció, a fehérje-összehajtás minőségellenőrzése és az ERAD funkcionálisan összekapcsolódik. Az ER-be való bejutás után az újonnan szintetizált polipeptidláncok nagy többsége N-hez kötött glikozilálódik. Az oligoszachariltranszferáz enzim felismeri az Asn-X-Ser/Thr konszenzus szekvenciát a születő fehérjemolekula nagy részében, és kovalensen integrál egy magas mannóztartalmú magglikán csoportot (Glc3Man9GlcNAc2) az ER membránon lokalizált dolicholból a fehérjébe. A fehérjéhez kötött oligoszacharid triglikozilált formájának nagyon rövid felezési ideje miatt a glikánfeldolgozás azonnal megkezdődik a prekurzor glikáncsoportok glükozidáz enzimek általi átadása után. A három glükózmaradvány közül kettő lehasadását követően a naszcens fehérje kölcsönhatásba léphet olyan minőségellenőrző lektinekkel, mint a CNX és a CLR. Ez a kölcsönhatás a fennmaradó glükózmaradványok hasításáig fennmarad. Miután a glikoprotein kiszabadul a CNX/CLR ciklusból, az utolsó glükóz is levágásra kerül, és így glikozilálatlan szubsztrát jön létre. Ez veszélyezteti a szubsztrát és a lektin chaperonok kölcsönhatását. Ebben a szakaszban, ha a fehérje megfelelően össze van hajtogatva, kiléphet az ER-ből a végső rendeltetési helyére. Ha azonban a glikoprotein még mindig nem hajtogatott, akkor az ER-ben marad, és az UDP-glükóz:glikoprotein glükozil-transzferáz által újra glükozilálódik, és a CNX és a CLR segítségével visszaalakul, így a fehérje több időt kap a megfelelő hajtogatásra. Még nem ismertek a reglikozilációs/deglikozilációs ciklusok befejezésében részt vevő mechanizmusok. Az azonban világos, hogy ha a polipeptidlánc ismételt hajtogatási kísérletek után sem tudja elérni érett formáját, a magglikán lánc terminális mannózmaradványait az ER α1,2-mannozidáz I (ERMan1) fokozatosan eltávolítja. Az ERMan1 Man8GlcNAc2 izomert állít elő az N-glikánok középső ágából egy mannózmaradék eltávolításával. Ezzel a trimmeléssel a glikoprotein szegényebb szubsztrátokká válik a reglikozilációhoz és a CNX-ciklusból való kilépéshez .

A megfelelően hajtogatott fehérjék hidrofób foltjai általában az oldható fehérjék belsejében vannak eltemetve. Ezek a foltok azonban a rosszul hajtogatott fehérjékben felszínre kerülhetnek. Ha egy fehérje exponált hidrofób felületekkel rendelkezik, a BiP kötődik hozzá, hogy elrejtse ezeket az aggregációra hajlamos felületeket a megfelelő hajtogatási kísérletekhez, megakadályozva az aggregációt. Ha azonban a hajtogatás nem sikerül vagy késik, a kiterjesztett chaperon-hibásan hajtogatott fehérje kölcsönhatás egy kifinomult folyamatot szolgál, ahol a fehérje átkerül más chaperonokhoz és/vagy az ERAD folyamatba.

Egyértelmű, hogy az ERAD első lépése a hibásan hajtogatott fehérjék chaperonok általi kiválasztása. Már 1999-ben megállapították, hogy az élesztő ERAD szubsztrátumok feltűnően különböznek az ER-luminális Hsp70, BiP iránti igényükben. Az oldható szubsztrátok, például a pαF és a vakuoláris proteáz karboxipeptidáz Y* (CPY*) mutáns formájának degradációja BiP-függő volt, míg a transzmembrán fehérjék, a Pdr5*p, Ste6-166p, Sec61-2p és Hmg2p degradációja BiP-független módon történt. 2004-ben kimutatták, hogy a citoszolikus doménnel rendelkező szubsztrátok, mint például a Ste6-166p BiP-függetlenül degradálódtak, míg a luminális defektusú fehérjék BiP-t igényeltek, ami arra utal, hogy a félregördült lézió topológiájától függően (ER lumen, ER membrán és citoplazma) citoszolikus vagy luminális chaperonok működnek a felismerésben és a degradáció célba juttatásában.

Az ERAD során a szubsztrátfelismerést modell félregördült fehérjék segítségével lehet tanulmányozni. Egyértelmű, hogy a de-mannoziláció szükséges a félrefordult glikoproteinek degradációjához, mivel ennek a mannóz trimmelésnek a gátlása stabilizálja a félrefordult glikoproteineket az ER-ben . Az ERMan1 túlexpressziója felgyorsítja az N-glikozilált fehérjék degradációját . Az így keletkező Man8-GlcNAc2 tartalmú glikoprotein e trimmelés után az EDEM1 (ER-degradációt fokozó mannozidáz-szerű fehérje 1, élesztőben Htm1p) – egy mannozidázzal kapcsolatos lektin – szubsztrátjává válik az ER-ben. Továbbá azt javasolták, hogy a félrecsúszott glikoproteinek ERManI és EDEM1 kölcsönhatásba lépnek ERAD-jukkal, és a lektin-szénhidrát kölcsönhatás kulcsfontosságúnak bizonyult az EDEM szubsztrát felismerésében . Bár az ERMan1-et a félrefordult fehérjék ERAD-ját elindító biológiai időzítőnek javasolták , a legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a mannozidázok nem kizárólagosan felelősek az ERAD során történő intenzív demannozilációért, különösen nem bazális körülmények között. ER stressz (kibontakozatlan fehérje válasz aktív) körülmények között az EDEM1 transzkripciós emelkedése fokozza az ERAD hatékonyságát az ERMan1 proteolitikus downregulációjának elnyomása révén. Úgy tűnt, hogy az EDEM-ek fontos szerepet játszanak a szubsztrátok demannozilációjában is . Az EDEM1 megakadályozza a reglikozilációt is, és elősegíti egyes ERAD-szubsztrátok retrotranszlokációját és degradációját . Másrészt, míg a Htm1p mannozidáz homológia doménje (MHD) szükséges a szubsztrátkötéshez, az emlős EDEM1 az MHD doméntől függetlenül köti a félrefordult fehérjéket, és ezért az EDEM1 szubsztrátkötés nem igényel mannóz trimmelést vagy akár glikozilációt . Így a glikoproteinek N-kötésű oligoszacharid-részei mellett az EDEM1 képes felismerni a félrefordult fehérjék hajtási elváltozásait is. Összefoglalva, az EDEM-ek közvetlenül vagy közvetve részt vesznek a glikoproteinek demannozilálásában és/vagy olyan receptorként szolgálnak, amely a mannóz-trimmelt fehérjéket megköti és célba veszi az ERAD számára (1. ábra).

A terminális mannóz C ágból történő rövidítése α-terminális α1,6 kötésű mannózmaradványokat tár fel, amelyek az ERAD lektinek, például az OS9 (élesztőben Yos9) és az XTP3-B számára felismerő jelként funkcionálnak (2. ábra). A mannóz-6-foszfát receptor homológia (MRH) doménjükön keresztül mindkét fehérje elsősorban az α1,6 kötésű mannóz j-t ismeri fel, emellett az OS-9 az α1,6 kötésű mannóz e-t és c-t is felismeri .

Számos beszámolók szerint a szubsztrátfelismeréshez és -célzáshoz szükséges faktorok (EDEM-ek, OS9 és XTP3-B) szupramolekuláris komplexekben helyezkednek el és/vagy fontos ERAD-szabályozókkal lépnek kölcsönhatásba . Például az EDEM1 kölcsönhatásba lép a CNX-szel, szubsztrátokat kap a CNX-ciklusból és elősegíti az ERAD-szubsztrát degradációját, mint például az NHK-α1-antitripszin mutáns . Az EDEM1 az ER retrotranszlokációs gépezet komponenseivel is társul. Feltételezhető, hogy az EDEM1 rosszul foldozott fehérjékhez kötődik, és MHD doménjét arra használja, hogy az aberráns fehérjéket a Hrd1-SEL1L ubikvitin ligáz komplex ER-rezidens glikoprotein SEL1L fehérjéhez irányítsa . A SEL1L számos luminális szubsztrátfelismerő faktor állványzatát és a Hrd1-hez kapcsolja őket. Az OS9 és az XTP3-B szintén társul a Hrd1-SEL1L komplexhez, amelyhez a BiP és a GRP94 is tartozik . Továbbá az XTP3-B-t a BiP és a Hrd1 komplex összekapcsolására javasolják . Egy hipotézis szerint ez a három chaperon (EDEM1, OS9 és XTP3-B) oligomerként működik, ahol az egyik monomer a szubsztráttal, a másik pedig a Hrd1-SEL1L komplexszel lép kölcsönhatásba . Ezenkívül az EDEM1 kölcsönhatásba lép a transzmembrán fehérjével, a transzlokon jelölt Derlinnel is ; továbbá a Derlin2 bizonyítottan fokozza az EDEM1 kölcsönhatását a citoszolikus AAA-ATPáz p97-sel, amely az ATP-hidrolízist a félrefordult fehérjék retrotranszlokációjához kapcsolja .

Ez egyértelmű, hogy az ERAD szubsztrátfelismerési lépése egy bonyolult mechanizmus, amelyben több különböző enzim és chaperon vesz részt, amelyek különböző, de összehangolt szerepet játszanak az ERAD-ban. Ráadásul a szubsztrátoktól függően változik az érintett fehérjék száma és jellemzői. Például az EDEM, az ERdj5 és a BiP összehangolt szerepét javasolták a félrecsúszott fehérjék lebontásában. A CNX-CLR ciklusból való kilépés után az EDEM1 tovább nyesegeti a Man8-GlcNAc2 glikán szerkezetet, az ERdj5 pedig csökkenti a diszulfátkötéseket. Ezzel egyidejűleg az ERdj5 aktiválja a BiP ATPáz aktivitását. Az ADP-hez kötött BiP kötődik a rosszul hajtogatott fehérjéhez és retrotranszlokációs komponens formájában tartja, amíg át nem kerül a retrotranszlokációs komplexbe .

Az ERAD a nem glikozilált fehérjék minőségellenőrzésében is részt vesz, ami független a lektinszerű fehérjéktől. Az immunglobulin könnyű lánc (Ig-K-LC), egy nem glikozilált ERAD-szubsztrát, BiP-függő módon degradálódik. Okuda-Shimizu és Hendershot jellemezte ennek a nem glikozilált BiP-szubsztrátnak az ERAD-útvonalát és a különböző fehérje kölcsönhatások dinamikáját, amelyek szerepet játszanak ebben a folyamatban. Az Ig-K-LC két intramolekuláris diszulfidkötéssel rendelkezik, és teljesen oxidált formája nem képes az ER-ből a citoplazmába jutni. A BiP kölcsönhatásba lép az Ig csak részben oxidált formájával, megakadályozza az Ig-K-LC teljes oxidációját, és ezáltal megkönnyíti a felszabadulását az ER-ből. Továbbá egy transzmembrán UBL domént tartalmazó fehérje, a homoCys-rezisztens ER-rezidens fehérje (HERP) a nem glikozilált BiP szubsztrátok receptoraként szerepel . A HERP kölcsönhatásba lép a Derlin1-gyel, és a részben oxidált Ig-K-LC a BiP-ről a HERP-Derlin1-Hrd1 komplexbe kerül, majd proteaszomális degradációra irányul . A BiP mellett az ERdj5 mint diszulfid-reduktáz is fontos szerepet játszik a nem glikozilált fehérjék ERAD-jában . A BiP által befogott nem glikozilált szubsztrátokat az ERdj5-nek adják át a diszulfidkötések hasítása céljából. Ezután ezek a szubsztrátok a BiP segítségével a SEL1L-hez kerülnek a retrotranszlokációhoz . A BiP mellett az OS9 és az XTP3-B is részt vesz a nem glikozilált fehérjék ERAD-jában .

.