Egy univerzális heparin antidotum elhanyagolható hatással a fibrin(ogen) és a plazma alvadására

Háttér és cél

Az antikoagulánsok kulcsfontosságú szerepet játszanak a tromboembóliás betegségek kezelésében. Az antikoagulánsokat kapó sebészeti betegek vérzései komoly aggodalomra adnak okot. Az antikoaguláció ellensúlyozására és a normális vérzéscsillapítás helyreállítására antidotumokat adnak. A mai napig a protamin-szulfát (PS), egy kationos polipeptid az egyetlen klinikailag engedélyezett antidotuma a frakcionálatlan heparinnak. A PS-nek toxikus mellékhatásai és korlátai vannak. Az alacsony molekulatömegű heparinok és a fondaparinux teljes visszafordítására való képtelensége a PS alacsony kötődési affinitásának köszönhető. A PS azonban kölcsönhatásba lép a véralvadási fehérjékkel, például a fibrinogénnel, és aggregátumokat képez, ami kardiovaszkuláris káros hatásokhoz vezet. A közelmúltban kifejlesztettünk egy szintetikus univerzális heparin-reverziós szert (UHRA), amely nagy kötődési affinitással rendelkezik a heparinokhoz. In vivo vizsgálatok kimutatták, hogy az UHRA teljesen visszafordítja az összes klinikailag elérhető parenterális antikoaguláns aktivitását, és nem toxikus. E tanulmány célja az UHRA nem-toxikus jellegének bizonyítása a fibrinogénre, a fibrinrög architektúrájára, a plazmaalvadásra és a röglízisre gyakorolt hatásának felmérésével.

Módszerek

Az UHRA-t úgy fejlesztették ki, hogy tercier amin alapú heparinkötő csoportokat építettek be egy dendritikus, hiperelágazó poliglicerinvázra, és metoxipolietilén-glikol láncokkal fedték le. Az UHRA-nak az alvadási rendszerre gyakorolt hatásának megértése érdekében rekalcifikációs és szöveti faktor (TF) által indított turbidimetriás plazmaalvadási vizsgálatokat végeztek. Az UHRA fibrinogénnel való kölcsönhatását fibrinogén-aggregációs próbával, fibrin-polimerizációs próbával és spektroszkópiai elemzéssel (fluoreszcencia és cirkuláris dichroizmus (CD)) vizsgálták. Az UHRA hatását a fibrin rögök architektúrájára pásztázó elektronmikroszkópiával (SEM) értékeltük.Az antikoagulánsok (heparinok) UHRA általi semlegesítését fluorogén trombintermelési teszttel (TGA) vizsgáltuk emberi vérlemezkékben gazdag plazmában (PRP). A TF által kiváltott, UHRA-t vagy PS-t tartalmazó, exogén szöveti plazminogén-aktivátornak (t-PA) kitett plazma rögök lízisét vizsgáltuk turbidimetriás teszttel.

Eredmények és vita

A plazma alvadási vizsgálatok eredményei azt mutatták, hogy az UHRA nem változtatta meg a rögképződési paramétereket a PS-hez képest (TF indított késleltetési idő és maximális abszorbancia, kontroll vs UHRA 200 mcg/ml, p=0.21 és 0,16, illetve; késleltetési idő és maximális abszorbancia a rekalcifikációban, kontroll vs. UHRA 200 mcg/mL, p=0,08 és 0,13, illetve), ami arra utal, hogy az UHRA a vizsgált koncentrációban nincs hatással az alvadási rendszerre (1. ábra). A protaminnal ellentétben a fibrinogén-aggregációs és fibrin-polimerizációs vizsgálatot az UHRA nem befolyásolta a 0,05 mg/ml és 1 mg/ml közötti széles koncentrációtartományban. A triptofán fluoreszcencia kioltási mérésekkel (2. ábra) és a fibrinogén másodlagos szerkezetének méréseivel együtt megerősíti, hogy az UHRA nem lép kölcsönhatásba a fibrinogénnel. Az eredmények teljesen eltérnek a PS-től és más szintetikus kationos polimerektől, amelyek kölcsönhatásba lépnek a fibrinogénnel, aggregációt és konformációs változásokat idézve elő. Az UHRA jelenlétében (még 0,5 mg/ml koncentrációban is) létrehozott fibrinrögök hasonló szerkezetet mutattak, és a szálak mérete megegyezett a normál fibrinrögökével (kontroll vs. UHRA 0,5 mg/ml rög, p= 0,12) (3. ábra). Másrészt a 0,05 mg/ml PS (klinikai dózis) jelenlétében képződött fibrinrögöknél megnőtt a rostméret és drámaian megváltozott a rögszerkezet (kontroll vs PS 0,05 mg/ml rög, p< 0,0001). Az exogén t-PA jelenlétében végzett plazma röglízis vizsgálataink azt mutatják, hogy az UHRA a protaminnal ellentétben nem fokozta a rög lebomlását. Az UHRA helyreállította a trombinszintet az antikoagulált (heparinizált) PRP-ben, bizonyítva a hatékonyságot.

Következtetés és jelentőség

Vizsgálataink azt mutatják, hogy az univerzális heparin antidotum, az UHRA elhanyagolható hatással van a fibrinogénre, a fibrin polimerizációra, a rögszerkezetre, a rög lebontására és a véralvadási rendszerre, ami a protaminhoz képest kiváló vérkompatibilitásukat mutatja. Eredményeink alátámasztják, hogy az UHRA ideális antidotum lehet az invazív sebészeti beavatkozásokat követő hemosztázis helyreállítására és a heparin alapú antikoagulánsok által okozott vérzési szövődmények kezelésére.