ChIP off the old block: A kromatin immunprecipitáción túl

Egy klasszikus módszerből – a kromatin immunprecipitációból (ChIP) – számos technika építkezik annak felmérésére, hogy mi és hol kötődik a DNS-hez. Az újonnan megjelenő technikák kicsinyítik a minták méretét, DNS-hez kötött fehérjekomplexeket kérdeznek le, vagy közelebbről értékelik az érintett nukleotidokat. Mindezen megközelítések célja a ChIP régóta fennálló korlátainak leküzdése, és a tudósok által a génszabályozással, fejlődéssel és betegségekkel kapcsolatban feltett kérdések bővítése.

A krómatin-immunprecipitációt, a molekuláris biológia egyik legszélesebb körben használt technikáját több mint 30 évvel ezelőtt találták fel – és néhány dolog változott vele kapcsolatban, míg mások ugyanazok maradtak.

Az alapvető protokoll még mindig hasonló az 1980-as években kifejlesztetthez, amely a fehérjék formaldehiddel való keresztkötését, majd a DNS fragmentálását jelenti. A DNS-sel kölcsönható fehérjét egy ellenanyag segítségével immunprecipitálják, a keresztkötéseket hővel visszafordítják, és a kapcsolódó DNS-t elemzik. A kutatók később összekapcsolták a technikát a mélyszekvenálással, és kifejlesztették a ChIP-seq technikát a fehérje-DNS kölcsönhatások genomi léptékű vizsgálatára.

A ChIP-et a transzkripciós faktorok működésének, a hisztonok génexpresszió modulációjának és más, a biológiai fejlődésre és betegségekre vonatkozó alapvető kérdéseknek a megválaszolására használták fel. Szeptemberben C. David Allis és Michael Grunstein elnyerte a rangos Lasker-díjat a hisztonokkal kapcsolatos munkájáért – a ChIP-re támaszkodó kutatásokért. A ChIP-seq ma már az ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) projekt egyik sarokköve, amelynek célja a genom szabályozó régióinak feltérképezése különböző sejttípusokban.

A kromatinbiológusok egy sor olyan spin-off vagy párhuzamos technológiát is fejlesztenek, amelyek túlmutatnak azon, amit a ChIP és a ChIP-seq kínál – a fehérjekomplexek vizsgálatára, a faktorok kötődésének pontosabb felmérésére, a kis sejttömegek vizsgálatára, és – kísérleti jelleggel – a fehérje-DNS kölcsönhatások értékelésének megkezdésére egysejtes szinten.

Ezek a technikák mindegyike olyan dolgokra törekszik, amelyekre a ChIP-seq önmagában nem, vagy csak lassan képes. És mindegyiknek ugyanaz az alapvető célja: megtudni, hogy milyen molekulák kapcsolódnak a DNS-hez és hol.

“Nem igazán értjük azokat az alapelveket, amelyek alapján a genomunkban található szabályozó funkcionális szekvenciák meghatározzák, hogy a gének hol és mikor lépnek működésbe” – mondja Bradley Bernstein, a Massachusetts állambeli Cambridge-ben található Broad Institute Epigenomikai Programjának igazgatója. Hozzáteszi, hogy a ChIP “sok szempontból korlátozott. És ezért vannak ezek az erőfeszítések, hogy megpróbáljunk új megközelítéseket kitalálni, vagy új módon adaptálni a technológiát.”

“Precíz, determinisztikus módszereket kell találnunk az egymolekulás kölcsönhatások közvetlen, szisztematikus értékelésére egyetlen sejtben”.

Munkába állítani

“Sötét művészetnek nevezni túlzás” – mondja Nir Friedman, az izraeli Héber Egyetem (The Hebrew University of Jerusalem) informatika és biológia professzora. De annak ellenére, hogy ez egy általánosan használt technika, “nagyon kevesen elég türelmesek ahhoz, hogy kalibrálják a kísérleteiket” – mondja.

A ChIP-seq kísérletek sok zajt generálnak, jegyzi meg Friedman. A formaldehid keresztkötéseket hozhat létre a nem érintett molekulák között, az antitestek nem célfehérjéket húzhatnak le, és a szonikáció – a DNS felbontásának legelterjedtebb módja – hajlamos a nyitott konformációban lévő DNS-t felbontani. Friedman szerint “előfordulhat, hogy annak, amit végül szekvenálunk vagy megnézünk, több mint a fele nem specifikus kötődés”.

Az ENCODE iránymutatásokat tesz közzé az antitestek minőségének értékelésére és az értelmetlen adatok kiszűrésére, jegyzi meg Friedman. A projekt hozzáférést biztosít a legújabb számítási eszközökhöz is, amelyeket például az adatok kontrollokhoz való normalizálására és a lehetséges DNS-kötődés “csúcsainak” vagy régióinak azonosítására használnak.

A megfelelő antitest kiválasztása különösen nagy kihívást jelenthet, jegyzi meg Michael-Christopher Keogh, az EpiCypher, egy epigenomikai vállalat tudományos vezetője az észak-karolinai Durhamben (Research Triangle Park). Keogh részt vett egy nemrégiben készült tanulmányban, amely kimutatta, hogy sok, a hisztonkutatásban népszerű antitest rosszul teljesít a ChIP-ben, például a célon kívüli epitópokhoz kötődik. A tanulmány az ENCODE-irányelveken túli validálási lépéseket is javasol.

Néhány kutató úgy kerüli meg az antitest-problémát, hogy epitópcímkét tervez a célpontra, mint a CETCh-seq (CRISPR epitope tagging ChIP-seq) esetében. Egy régóta ismert technika, a DamID (DNS-adenin-metiltranszferáz-azonosítás) olyan mérnöki tényezőket foglal magában, amelyek a szomszédos DNS-t molekuláris jelölésekkel látják el.

Más kutatók még mindig fejlesztik az alapvető ChIP-technikát, például Alon Goren csoportja a Kaliforniai Egyetem San Diegó-i Orvosi Tanszékén, amely teljesen automatizálta a ChIP-seq-et. Goren szerint az optimális antitestkoncentráció antitestenként és sejttípusonként jelentősen eltérhet, és egyes lépések, például a fordított keresztkötés, szükségtelenek. A Goren Laboratórium azt is kimutatta, hogy a monoklonális antitestek előnyben vannak a poliklonális antitestekkel szemben.

A ChIP-seq azonban még teljesen optimalizálva is alapvetően korlátozott. Például általában 100 000 vagy több sejtre van szükség a transzkripciós faktorok értékeléséhez, és 10 000 vagy több sejtre a hisztonfehérjék értékeléséhez, mondja Goren. A legtöbb esetben pedig a módszer egy-egy fehérje, egy-egy antitest vizsgálatára irányul.

Mondja Goren: “Ha egyszer képesek leszünk a fehérjékről a komplexekről való gondolkodásra áttérni, sokkal jobban megértjük majd, hogyan működik a biológia, és mi történik a betegségekben.”

A fehérjekomplexek megismerése

A komplexek vizsgálatának egyik megközelítése a ChIP-seq és a tömegspektrometria (MS) kombinálása, olyan módszerek alkalmazásával, mint a RIME (Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins) és a ChIP-MS.

Ezeknek a módszereknek azonban az egyik hátránya, hogy a DNS-hez nem kapcsolódó fehérjéket is lehúzhatja az immunprecipitáció, mondja David Steger, a philadelphiai Pennsylvaniai Egyetem molekuláris biológusa. Ehelyett, mondja Steger, “amit mindenki megpróbál kifejleszteni, az a lokusz-specifikus proteomika egy adott enhancerben”.

A kromatinhoz kötött komplexek értékelésének egyik új keletű technikája a ChIP-SICAP (kromatinhoz kapcsolódó fehérjék szelektív izolálása), amelyet Jeroen Krijgsveld csapata a heidelbergi Német Rákkutató Központban (Németország) és munkatársai fejlesztettek ki. A technika során az antitesthez kötött DNS-t biotinnal jelölik meg, amelyet aztán biotin-kötő streptavidin gyöngyökkel húznak le a tömegspektrometriás vizsgálat előtt.

Steger a ChIP-SICAP-ot olyan enhancerekhez kötött fehérjék vizsgálatára alkalmazza, amelyek a mesenchymális őssejtek zsírsejtekké való átalakulását irányítják. Steger azt mondja: “Amit próbálunk tenni, az az enhancer-proteom azonosítása”.

Más megközelítések a Cas9-et tartalmazó génszerkesztő rendszert hasznosítják, amely felismeri a specifikus DNS-szekvenciákra célzott vezető RNS-eket. A kutatók a Cas9-et biotinnal vagy egy olyan enzimmel jelölték meg, amely elősegíti a közeli fehérjék biotinnal történő jelölését, amelyeket MS-sel elemeznek. Ezt a megközelítést távoli genomi elemek közötti kölcsönhatások feltárására is alkalmazták. Az ilyen módszerek potenciálisan bővíthetik a ChIP-seq-hez kapcsolódó olyan módszerek repertoárját, amelyek képesek a genom 3D architektúrájának értékelésére, mint a Hi-C, a ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag sequencing) és a HiChIP, valamint az újabb módszerek, mint a SPRITE (Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension).

Ezek a DNS-hez kötött komplexek értékelésére szolgáló új módszerek azt ígérik, hogy élesebbé teszik a biológusok képét a génszabályozásról. Az MS-hez alkalmazva azonban azzal a korlátozással szembesülnek, hogy az MS nem képes könnyen kimutatni az alacsonyabundanciájú fehérjéket, jegyzi meg Steger. Ráadásul nem minden újabb technika hozzáférhető a nem szakértő számára.

Néhány vállalat kínál szolgáltatásokat az olyan bevett technikák kiszervezésére, mint a RIME vagy a ChIP-seq. A ChiP-seq és kapcsolódó szolgáltatásokat kínáló cégek közé tartozik a kaliforniai Carlsbadban működő Active Motif, a belgiumi Liege-ben és a New Jersey-i Denville-ben működő Diagenode, valamint a pekingi székhelyű Novogene. Ezek és más cégek ChIP-seq-készleteket és komponenseket is kínálnak, bár sok laboratórium maga állítja elő a reagenseket. Keogh azt is megjegyzi, hogy a házon belüli kutatás nagyobb ellenőrzést jelenthet az optimalizálási lépések tekintetében.

A ChIP-kísérletek során a kísérleti paraméterekkel való óvatosság önmagában is növelheti az adatok minőségét, mondja Cigall Kadoch, akinek csoportja több nagy makromolekuláris fehérjekomplexet vizsgál a Dana-Farber Rákintézetben és a Harvard Medical Schoolban Bostonban, Massachusettsben.

Kadoch gondosan optimalizálja a fehérjék egymással és a DNS-sel való keresztkötéséhez használt formaldehid koncentrációját minden egyes antitest és sejttípus esetében. Az antitestek kiválasztásakor megjegyzi, hogy az epitóp az előrejelzések szerint hozzáférhető-e a felszínen, és ezért alkalmas-e az immunprecipitációra. A teljesen összerakott komplex DNS-lábnyomának megtekintéséhez pedig azt tanácsolja, hogy olyan fehérjéhez válasszunk ellenanyagot, amelyet az összerakási folyamat végén adunk hozzá. “Ezek azok a dolgok, amelyek eldöntik vagy megtörik a projektet” – mondja Kadoch.

A faktorok kötődésének meghatározása

Egy másik technika, amelyet Steger használ, a ChIP-exo (ChIP exonukleáz). Ezt alkalmazza annak azonosítására – bázispáros felbontásban -, hogy a különböző faktorok hol kötődnek a genomhoz.

Ez a technika a DNS szonikációval történő fragmentálásával kezdődik. Egy exonukleáz szétrágja a DNS-t (5′-3′ irányban) egészen addig a széléig, ahol a DNS formaldehiddel kapcsolódik a megkötött fehérjéhez. Ez a megközelítés a kötött faktorok éles DNS-“lábnyomát” eredményezi, amely pontosabb lehet, mint a ChIP-seq segítségével számítással előállított következtetett motívumok.

“Mindig ChIP-seq-vel kezdünk, és ahogy a kérdéseink fejlődnek, áttérünk a ChIP-exo módszerre” – mondja Steger, aki a technikát a glükokortikoid-receptor DNS-hez való kötődésének értékelésére használta. A receptor dimerként kötődik két egymás melletti, rövid DNS-szekvenciához. Steger fel tudta oldani az egyik monomer kötődését, amit a ChIP-seq-vel nem tudott megtenni.

A pennsylvaniai University Parkban található Penn State University biokémia és molekuláris biológia professzorának, Frank Pughnak a csapata nemrég egyszerűsítette a ChIP-exo módszerét, és az általánosan használt Illumina szekvenáló platformhoz igazította. Hasonlóképpen Julia Zeitlinger, a Missouri állambeli Kansas Cityben található Stowers Institute for Medical Research munkatársa és kollégái egy kapcsolódó technikát, a ChIP-nexus-t tették közzé. Mindkét fejlesztés “ígéretes”, mondja Michael Snyder, a kaliforniai Stanford Egyetem genetikai tanszékvezetője és a Stanford Center for Genomics and Personalized Medicine igazgatója.

Kisebbre és mélyebbre megyünk

A kutatóknak sikerült lefaragniuk a ChIP-seq-hez szükséges sejtek számát a kísérleti paraméterek módosításával, például jó minőségű ellenanyag használatával, mondja Friedman.

Egyik technika, köztük a Friedman által kifejlesztett, vonalkódolt szekvenáló adaptereket használ, ami lehetővé teszi a minta méretének csökkentését. A “ChIPmentation” nevű új technika pedig csökkenti a szekvenáló könyvtárak készítésének lépéseit.

Az egyik, új laboratóriumokba kerülő módszer a CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease), amelyet Steve Henikoff és munkatársai fejlesztettek ki a washingtoni Seattle-ben található Fred Hutchinson Rákkutató Központban. Ez a módszer nélkülözi a formaldehiddel történő keresztkötést, valamint a szonikációval történő DNS-nyírást. Ehelyett a célpont elleni antitestet mikrokocka nukleázhoz (MNáz) kötik, amelyet kalcium aktivál, hogy a célpont két oldalán lévő DNS-t hasítsa. A keletkező DNS-darabkákat szekvenálják.

“A ChIP-seq-hez képest nagymértékben csökken a jel-zaj viszony” – mondja John Stamatoyannopoulos, a seattle-i Altius Institute for Biomedical Sciences igazgatója. Ez részben annak köszönhető, hogy a nukleáz tisztán vágja a DNS-t, és csak kis mennyiségű off-site vágás történik. Ennek eredményeképpen a CUT&RUN jellemzően kevesebb DNS-szekvenálási leolvasást igényel, mint a ChIPseq – ami csökkenti a költségeket -, és sokkal kisebb sejtszám esetén alkalmazható. Henikoff csapata nemrégiben 1000 sejtre alkalmazta a technikát egy transzkripciós faktor és 100 sejtre egy hiszton-módosítás esetében. Stamatoyannopoulos szerint a módszer nagyrészt kiszorította a ChIP-seq-et a laboratóriumaiban.

CUT&A RUN-nak az alacsony sejtszámon túl is vannak előnyei. Stuart Orkin, molekuláris biológus és a Harvard Egyetem professzora a technikát “lényegében nukleotid-szintű” felbontása miatt dicséri. A számítási eszközök kisebb módosításával csoportja képes volt megkülönböztetni a magzati hemoglobin kifejeződésének szabályozásában részt vevő transzkripciós faktor szorosan elhelyezkedő kötőhelyeit. Ezt az eredményt megelőzően nem tudta immunprecipitálni a transzkripciós faktort hagyományos ChIP-vel, valószínűleg azért, mert a formaldehid keresztkötés elrejtette az epitópokat. A CUT&RUN “rögtön működött” – mondja.”

Henikoff laboratóriuma adaptálta a technikát a hosszú távú, 3D-s DNS kölcsönhatások értékelésére, és a lehasított fragmentumok immunprecipitációjának elvégzésére egy második antitest segítségével. A csoport két molekuláris jellemzőt kérdezett le ugyanazon a fehérjekomplexen – ez a megközelítés segíthet megoldani olyan kérdéseket, mint például, hogy a hisztonjelek mely kombinációi társulnak különböző génállapotokhoz.

Munka az egysejtűek szintjén

Sok molekuláris biológus, köztük a kromatinkutatók számára az egysejtűek jelentik a végső határt.

“Precíz, determinisztikus módszereket kell találnunk az egymolekulás kölcsönhatások közvetlen, szisztematikus értékelésére az egyes sejtekben” – mondja Bernstein. “Ez egy hosszú távú cél.” Az egysejtes adatok potenciálisan nyomon követhetik a DNS-kötő faktorokat, amikor a sejtek kilépnek az őssejt állapotból a fejlődés során, vagy a nagyfokú sejtheterogenitású daganatokban.

Ez a célhoz több megközelítés is egyre közelebb kerül. Azonban “sok egysejtes módszer érzékenysége korlátozott” – mondja Christopher Benner, a San Diegó-i Kaliforniai Egyetem genombiológusa. Bernstein és munkatársai például egysejtes ChIPseq-adatokat hoztak létre mikrofluidikus rendszer és vonalkódolás segítségével. A technika minden egyes sejtből 500-10 000 egyedi “olvasatot” rögzített, amelyek egy DNS-kötési eseményt jelentenek, ellentétben a sejtpopulációkkal rögzített több millió olvasattal.

A genom aktív régióiról is több módszerrel lehet adatokat nyerni. Az ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) egy hiperaktív transzpozázzal dolgozik, amely nyílt kromatin régiókban integrálódik a genomba, és szekvenáló adaptorokat vezet be. Az ATAC-seq adaptálható egyetlen sejtre, és az így kapott szekvenciaadatok számos számítási megközelítéssel vizsgálhatók. Ezek a megközelítések például képesek a promóterszekvenciák azonosítására – vagy a DNS-szabályozó elemek egyidejű kiiktatásával vagy az RNS-expresszió értékelésével végzett kísérletek mintázatainak azonosítására.

Az ATAC-seq hátrányokkal küzd, mint például a nem teljes integráció a hozzáférhető régiókban, jegyzi meg Snyder. A technika azonban nagy teljesítményű lehet: fluorofórák beillesztésére és képalkotására is bevethető, ami a szekvenálást megelőzően képalkotó adatokat eredményez a 3D genomiális szerveződésről, jegyzi meg Snyder.

Snyder rámutat az olyan laboratóriumokban végzett képalkotó munkára, mint például Alistair Boettigeré a Stanfordon, aki olyan módszereket fejleszt ki, amelyekkel szuperfelbontású képalkotással egyszerre lehet képet készíteni genetikai elemekről és születő RNS-átiratokról, hogy felmérjék, mely elemek segítik elő vagy fojtják el a génexpressziót. “A képalkotás a jövő” – teszi hozzá Stamatoyannopoulos. Más kutatók megjegyzik, hogy ahogy a “harmadik generációs” nanopórus-szekvenálás fejlődik, ChIP-szerű módszereket fognak kifejleszteni, amelyek csatlakoztathatók hozzá.

“Lehet, hogy teljesen ortogonális módszerekre lesz szükségünk” – mondja Bern-stein az egysejtes kromatinelemzésről. Ezt a célt végül valószínűleg sikeresen el lehet majd érni, mondja, “olyan technológiákkal, amelyek radikálisan eltérnek attól, amit most használunk”.

Az új termékről szóló sajtóközleményt/leírást vagy termékismertetőt küldje el a [email protected] címre. További információkért látogasson el a Science New Products oldalára.

Az újonnan kínált műszerek, készülékek és laboratóriumi anyagok, amelyek a tudományos, ipari és kormányzati szervezetek minden tudományágban dolgozó kutatói számára érdekesek, ezen a helyen szerepelnek. A hangsúlyt a termékek és anyagok céljára, fő jellemzőire és elérhetőségére helyezzük. A Science vagy az AAAS nem támogatja az említett termékeket vagy anyagokat. További információk a gyártótól vagy a szállítótól szerezhetők be.