Caco-2 permeabilitási vizsgálat

Kérdések és válaszok a Caco-2 permeabilitással kapcsolatban

Kérjük, adjon áttekintést a Cyprotex Caco-2 permeabilitási vizsgálatáról.

A Caco-2 sejteket széles körben használják in vitro modellként az emberi gyógyszerfelszívódás előrejelzésére. A Caco-2 sejtvonal humán kolorektális karcinómából származik, és tenyésztés során a sejtek spontán differenciálódnak polarizált enterociták monorétegeivé.

A sejteket multiwell-betétes lemezekre vetik, és a kísérlet előtt 20 nappal konfluens monoréteget képeznek. A 20. napon a vizsgált vegyületet a membrán apikális oldalára adjuk, és 2 órán keresztül figyeljük a vegyület monorétegen keresztüli áramlását. A hatóanyag-kiáramlás vizsgálatához a vegyületnek a bazolaterális rekeszből az apikális rekeszbe történő transzportját is vizsgálni kell.

A permeabilitási együtthatót (Papp) a következő egyenletből számítjuk:

Melyben dQ/dt a hatóanyag sejteken keresztüli permeációs sebessége, C0 a donorkoncentráció a nulladik időpontban és A a sejtmonoréteg területe.

Hogyan értelmezzem a Caco-2 permeabilitási vizsgálatból származó adatokat?

A Caco-2 permeabilitási vizsgálatból származó adatok többféleképpen is felhasználhatók. Először is, a vegyületeket a Papp-értékük alapján lehet rangsorolni. Két referencia vegyületet, az atenololt (passzív paracelluláris transzport) és a propranololt (passzív transzcelluláris transzport) a vizsgált vegyületek mellett szűrjük. Az atenolol és a propranolol humán felszívódása 50%-os, illetve 90%-os2,3 , és markerként használható a tesztvegyületek rangsorolásához. Másodszor, az adatok más in vitro paraméterekkel együtt felhasználhatók egy vegyület in vivo orális farmakokinetikájának előrejelzésére a Cloe PK szimulációs szoftver segítségével. Harmadszor, a Caco-2 adatok felhasználhatók a vér-agy gát (BBB) permeabilitás előrejelzésére (3. ábra).

3. ábra
A Caco-2-ből származó Pactive ((PappB-A – PappA-B)/2) és az in situ BBB permeációs sebesség, logPS (permeabilitás-felület termék) közötti korreláció. A BBB-n átjutó ismert gyógyszerek (koffein, imipramin, progeszteron) logPS >-2,0 (zöld árnyékolt terület), míg a BBB-n át nem jutó ismert gyógyszerek (aldoszteron, hidrokortizon, cimetidin) logPS ≤-3,5 (rózsaszín árnyékolt terület).

A regressziós egyenes látható, amely egyértelmű korrelációt mutat a Pactive és a logPS között azon vegyületek esetében, amelyeknél a Caco-2 sejtekben nem tapasztalható jelentős mértékű efflux aktivitás, azaz, a < 5 × 10 -6 cm/s Pactive értékű vegyületek esetében. Ezt a korrelációt felhasználva a Cyprotex Caco-2 tesztje használható a < 5 × 10 -6 cm/s Pactive értékű vegyületek BBB-potenciáljának értékelésére.

Milyen kapcsolat van a Caco-2 permeabilitás és a humán bélrendszeri felszívódás között?

A Caco-2 permeabilitás (pH7,4 HBSS pufferek használatával az apikális és a bazolaterális kompartmentben egyaránt) és a humán bélrendszeri felszívódás közötti kapcsolat a 4. ábrán látható. Ez az összefüggés jellemző az irodalomban e két paraméterre vonatkozóan megfigyelt összefüggésekre4. Fontos megjegyezni, hogy ezt az ábrát befolyásolja a bélabszorpciós adatok pontossága. Az ábrán használt bélabszorpciós értékek a Zhao és munkatársai (Zhao et al. 20012) adataiból származnak. Ebben a tanulmányban az emberi bélrendszeri felszívódási adatokat különböző forrásokból vették, és azok minősége jelentősen változik. Számos vegyületről ismert, hogy dózisfüggő felszívódást is mutat (a grafikonon hibasávok jelzik).

4. ábra
A Caco-2 permeabilitás és a humán bélrendszeri felszívódás %-os aránya közötti összefüggés.

Mi a különbség a PAMPA és a Caco-2 permeabilitási vizsgálat között?

A Caco-2 permeabilitási szűrést reprezentatívabbnak tartják az in vivo humán felszívódásra, mint a PAMPA-t (párhuzamos mesterséges membránpermeabilitási vizsgálat). A PAMPA kizárólag a passzív diffúzió mérését biztosítja, míg a Caco-2 modell jobban előrejelzi a humán felszívódást olyan vegyületek esetében, amelyek aktív felvételt vagy kiáramlást mutatnak, vagy paracelluláris úton haladnak át a membránon. A két vizsgálatból származó, együttesen használt információ értékes lehet a gyenge felszívódás kiváltó okának azonosításában.

Hogyan mérhető a hatóanyag-kiáramlás?

A kétirányú Caco-2 permeabilitási vizsgálatot végzik, ahol a vegyület transzportját mérik az apikális-bazolaterális irányban, valamint a bazolaterális-apikális irányban. Az eredményt jellemzően efflux-arányként, azaz Papp(B-A)/Papp(A-B) értékként adják meg. Ha az efflux arány nagyobb, mint kettő, akkor ez azt jelzi, hogy gyógyszer-kiáramlás történik. A talinololt, egy ismert P-gp szubsztrátot, kontrollvegyületként szűrjük annak megerősítésére, hogy a sejtek funkcionális efflux transzporter fehérjéket expresszálnak.

Honnan tudja, hogy a sejtek konfluens monoréteget képeztek-e?

A transzepithelialis elektromos ellenállás (TEER) mérését a sejtek közötti szoros kötés kialakulásának meghatározására használják. Ezenkívül a kísérlet kezdetén lucifer-sárgát, egy membránintegritás-markert koinkubálunk a vizsgált vegyülettel. Ha a lucifer sárga Papp értéke meghaladja az 1,0 × 10 -6 cm/s értéket az egyik kútban, de a vizsgált vegyület vagy a kontrollvegyület Papp értéke az adott kútban minőségileg hasonló a többi replikációs kút(ok)ban meghatározott eredményhez (a lucifer sárga küszöbértékén belül), akkor a felelős tudós tudományos megítélése alapján a sejtmonoréteg elfogadhatónak tekinthető. Ha ez nem így van, akkor az érintett monorétegből származó eredményt ki kell zárni, és n=1 eredményt kell jelenteni, vagy a vegyületet újra kell vizsgálni. Ha mindkét replikátum érintett, akkor a vegyületet újra kell vizsgálni. Ha ugyanannak a vegyületnek két különböző alkalommal mindkét lucifer-sárga Papp-értéke sikertelen, akkor feltételezzük, hogy a vegyület vagy citotoxikus hatást fejt ki a Caco-2 sejtekkel szemben, vagy inherens fluoreszcenciát mutat.

Hogyan és miért számítjuk ki a % recovery-t?

A % recovery hasznos lehet a Caco-2 adatok értelmezésében. Ha a visszanyerés nagyon alacsony, az a rossz oldhatósággal, a vegyületnek a lemezhez való kötődésével, a Caco-2 sejtek anyagcseréjével vagy a vegyületnek a sejtmonolayerben való felhalmozódásával kapcsolatos problémákra utalhat.