Az elektroporáció és a konkurens transzfekciós módszerek

A gének közvetlen bevitelén kívül az elektroporáció megkönnyíti a plazmidok közvetlen átvitelét sejtek vagy fajok között – például baktériumokból élesztőbe.

Kiterjedt kísérleteket folytatnak az elektroporáció felhasználásával a gyógyszerek és vakcinák közvetlenül az élő szervezetek sejtjeibe való juttatására. Ez a cikk a nem orvosi alkalmazásokra összpontosít.

Az elektroporációt leggyakrabban a sejtek átmeneti transzfekciójára használják, bár stabil transzfekció is lehetséges. A biofarmáciai iparban az átmeneti transzfekció lehetővé teszi akár néhány gramm fehérje előállítását jellemzéshez és preklinikai vizsgálatokhoz. Ebben az alkalmazásban a plazmidokat használó elektroporáció megbízhatónak és kiszámíthatónak bizonyult. Az elektroporáció hasonlóképpen stabilan transzfektált sejteket eredményez, feltéve, hogy a DNS-t linearizált formában juttatják be úgy, hogy azt előbb egy restrikciós enzimmel kezelik.

Egy technika a sok közül

Az elektroporáció szilárd helyet foglal el a transzfekciós technikák fegyverzetében, amelyek között vírusvektorok, kémiai vagy reagens alapú módszerek és mechanikus génszállítás szerepelnek. A vírusvektorok a legelterjedtebb módszer stabilan transzfektált sejtek előállítására terápiás fehérjék előállításához. A vírusvektorok nagyon nagy transzfekciós hatékonyságot biztosítanak, de korlátozottak a beillesztett DNS hossza tekintetében. A vírusvektorok a biológiai biztonsággal és a mutagenezissel kapcsolatos problémákkal is szembesülnek.

Kísérletileg más mechanikai technikákat is alkalmaznak, mint a mikroprecipitáció, mikroinjekció, liposzómák, részecskebombázás, szonoporáció, lézerindukált poráció és a gyöngyös transzfekció. Ezeknek a mechanikai technikáknak van egy közös vonásuk. Megbontják a sejtmembránokat, és ezáltal lehetővé teszik a DNS bejutását a sejtbe. Egyes megközelítések – például a “génágyú” – a géneknek közvetlenül a membránon keresztül a citoplazmába történő vetítésével járnak. Innen a gének a sejtmagba vándorolhatnak.

Emellett léteznek hibrid technikák, amelyek kihasználják a mechanikai és a kémiai transzfekciós módszerek képességeit. Az elmúlt évtizedben például számos cikk jelent meg a magnetofekcióról, egy olyan transzfekciós módszerről, amely a kémiai transzfekciót mechanikai módszerekkel kombinálja. A kationos lipidek például génágyúkkal vagy elektroporátorokkal kombinálva alkalmazhatók. A magnetofekciós irodalom nagy része gének és terápiás molekulák élő szervezetbe juttatásával foglalkozik.

Az elektroporációnak számos előnye van: sokoldalúság (bármilyen sejttípussal működik), hatékonyság, nagyon alacsony DNS-igény és az élő szervezetekben való működés lehetősége. Hátrányai közé tartozik a lehetséges sejtkárosodás és a molekulák nem specifikus szállítása a sejtbe és a sejtből.

A kémiai, mechanikai és vírusos transzfekciós megközelítések közül azonban egyedül az elektroporáció nyújt ésszerű bizonyosságot a sikerre, függetlenül a célsejtektől vagy a célszervezettől.

A kémiai transzformáció és az elektroporáció például két vezető módszer a DNS Escherichia coliba történő bevitelére. Az utóbbinál a baktériumokat először “kompetenssé” kell tenni a puffer sók eltávolításával, hogy az áram elérje a sejteket, majd az elektromos impulzust 0°C-on kell alkalmazni a mikroorganizmusok károsodásának csökkentése érdekében. A kémiai átalakítás CaCl2-ben való szuszpenzióval történik, ami pórusokat hoz létre, majd ezt követi a DNS-t a sejtekbe söpörő hősokk.

Egy másik megközelítés kationos lipideket használ a sejtmembránok felfeszítésére. Az elektroporáció kevésbé körülményes és hatékonyabb, változatosabb sejttípusokon működik, és könnyebben alkalmazható standard módszerekkel, mint a kémiai transzfekció. Egyes kutatók azonban inkább a kémiai transzformációt részesítik előnyben, mivel ehhez nem kell műszert vásárolni.

Innováció lehetővé tétele

Az elektroporáció, bár először 1965-ben írták le, továbbra is utat nyit az innovatív tudomány felé a műszerek, protokollok és kísérletek tekintetében. Legalább egy tucat egyetemi csoport fejlesztett ki mikroelektromechanikus rendszereken (MEMS) alapuló elektroporációs eszközöket. A mikrocsatornás eszközök egyik előnye, hogy úgy tervezhetők, hogy csak annyi feszültséget alkalmazzanak, amennyi elegendő az ésszerű makromolekula beépülés eléréséhez. Ez az előny egyben hátrány is. A kereskedelmi elektroporációs rendszerekkel ellentétben a chipek nem működnek minden sejttel.

A Louisiana Tech University Biomedical Engineering Tanszékének Shengnian Wang, Ph.D. által vezetett csoportja megállapította, hogy az arany nanorészecskék javítják a kereskedelmi elektroporációs berendezések teljesítményét.1 Wang úgy véli, hogy a nagy vezetőképességű részecskék csökkentik a sejtközeg vezetőképességét, miközben “virtuális mikroelektródaként” segítik a foszfolipid membránok megnyitását. Állítása szerint az alacsonyabb porációs feszültségek révén megnövelt teljesítményt (jobb DNS-szállítási hatékonyságot) és nagyobb sejtéletképességet biztosítanak.

A Charité Universitätsmedizin Berlin2 kutatói kombinált négyzetimpulzusos elektroporációs stratégiát dolgoztak ki a sejtek reprodukálható transzfekciójára. Dr. Britta Siegmund és munkatársai pufferben szuszpendálják a sejteket, és egy kezdeti magasfeszültségű impulzusnak vetik alá őket, amelyet egy eltérő elektromos és időbeli értékű alacsonyfeszültségű impulzus követ. Dr. Siegmund azt állítja, hogy az életképesség a hagyományos elektroporációhoz hasonló, és a transzfekciós hatékonyság akár 95%-os is lehet. Arra a következtetésre jut, hogy a technika “könnyen adaptálható a nehezen transzfektálhatónak tartott sejtek esetében.”

A szokásos DNS-átvitel mellett a transzfekciót alkalmazták interferáló RNS különböző sejttípusokba történő bejuttatására is. A technika lehetővé teszi az adagolás és a szállítás hatékonyságának ellenőrzött, kisléptékű vizsgálatát. Az adagolással és a bejuttatással kapcsolatos problémák megnehezítették az RNS-interferencia gyakorlati alkalmazását a terápiában. De legalább egy tanulmány megkérdőjelezte, hogy az RNS-interferencia gének leghatékonyabban transzfekciós reagensekkel vagy elektroporációval épülnek-e be primer sejtekbe.3

Kirsty Jensen, Ph.D., és munkatársai az Edinburghi Egyetemen összehasonlították 11 tranziens transzfekciós reagenskészlet és az elektroporáció hatékonyságát az immunmoduláló mediterrán láz gén (MEFV) elnémítására szarvasmarha-monocitákból származó makrofágokban. A csoport a kis interferáló RNS felvételére, a célgén kiütésére, a sejttoxicitásra és az I. típusú interferonválasz indukciójára vonatkozó módszereket vizsgálta.

Az elektroporáció körülbelül ugyanolyan hatékony volt a MEFV kiütésében, mint a transzfekciós reagensek. A reagensekkel ellentétben az elektroporáció nem indukált interferonválaszt, de a sejtek életképessége alacsonyabb volt. Az elektroporáció életképességének és transzfekciós hatékonyságának kérdéseit általában a technika névleges értékelésének tekintik.”

Dr. Jensen arra a következtetésre jutott, hogy “a transzfekciós reagensek használata alkalmasabb, mint az elektroporáció a gazdaszervezet makrofág génjeinek a fertőzésre adott válaszban betöltött szerepét vizsgáló munkánkhoz”, de “a kis interferáló RNS sejtekbe történő transzfektálása vagy elektroporációja közötti választás az egyes kísérletektől függ.”

Legalábbis néhány esetben, amikor az elektroporáció eredményei nem voltak optimálisak, a kutatók elhanyagolták az elektromos impulzus erősségén kívüli feltételek optimalizálását. Ahogy Hu és munkatársai nemrégiben megjegyezték,4 az elektroporáció hatékonyságát olyan nem elektromos tényezők befolyásolják, mint a sejt- vagy szövettípus és a DNS-formuláció.”

Az elektroporáció mára mind az in vitro, mind az in vivo fejlődésbiológia nélkülözhetetlen módszerévé vált. E munka jelentős része egyetlen sejtben történik, hozzájárulva a terápiában, a diagnosztikában, a gyógyszeradagolásban és a sejtbiológiában nagy érdeklődésre számot tartó modellhez. Az egyes sejtek közvetlen nanoporciója nehézkes a porció utáni életképességben rejlő bizonytalanság miatt.

A Northwestern Egyetem kutatói olyan egysejtes technikát fejlesztettek ki, amely magas életképességet és hatékonyságot biztosít.5 Megközelítésük egy mikrogyártott konzolos eszközt, a nanofountain szondát (NFP) használja. Ez kíméletesebben juttatja el a molekulákat a sejtekhez, mint a tömeges mikroinjekció vagy a nanoporció. A kutatók egyes HeLa sejtek NFP-vel közvetített elektroporációját mutatták be 95%-nál jobb transzfekciós hatékonysággal, 92%-os életképességgel és minőségi dóziskontrollal.

Az NFP-k előrelépést jelentenek a régebbi, atomerő-mikroszkópos szondákat alkalmazó transzfekciós technológiákhoz képest. Az atomerő-mikroszkópián alapuló technikák gyakran okozzák a sejtek kötődésének elvesztését vagy szakadását. Az NFP kevésbé károsítja a sejteket.