A kéz-, láb- és szájbetegséghez társuló Echovirus 4

VIROLÓGIA

A kéz-, láb- és szájbetegséghez társuló Echovirus 4

Echovirus 4 associado à doença de mão, pé e boca

Denise Hage Russo; Adriana Luchs; Bráulio Caetano Machado; Rita de Cássia Carmona; Maria do Carmo Sampaio Timenetsky

Enterikus vírusok laboratóriuma, Adolfo Lutz Intézet, São Paulo, SP, Brazília

Korrespondencia

Összefoglaló

A kéz-, láb- és szájbetegség (HFMD) egy fertőző enterovírusfertőzés, amely elsősorban gyermekeknél fordul elő, és hólyagos palmoplantáris kitörések és eróziós szájgyulladás jellemzi. Az Echovirus 4 (EV-4) gyakran aszeptikus meningitisszel hozható összefüggésbe. Korábban nem számoltak be a HFMD és az EV-4 összefüggéséről. Egy 14 hónapos gyermek két mintáját, aki enyhe lázzal, sebekkel a szájban, kiütésekkel és hólyagokkal a tenyéren és a talpakon jelentkezett, elküldték az Adolfo Lutz Intézet Enterális Vírusok Laboratóriumába. A klinikai mintákat három különböző sejtvonalba oltották be, és azokat, amelyek citopátiás hatást (CPE) mutattak, közvetett immunfluoreszcens vizsgálatnak (IFA) és “egylépéses” RT-PCR-nek vetették alá. Az RT-PCR termékből végzett agaróz gélelektroforézis 437 bp hosszúságú terméket mutatott ki, amely az Enterovírus csoportra jellemző. Az Echovirus 4-et az IFA segítségével azonosították. Bár a HFMD elsősorban az Enterovirus 71 (HEV-71) és a Coxsackievirus A16 (CV-A16) vírusfertőzés, eredményeink a HFMD-vel kapcsolatos szerotípusok sokféleségét mutatják, és hangsúlyozzák a járványügyi felügyelet fontosságát e betegség és szövődményei tekintetében.

Kulcsszavak: Hand, foot and mouth disease; Enterovirus; Echovirus.

RESUMO

A Doença de Mão, Pé e Boca (DMPB) é uma infecção enteroviral contagiosa que ocorre principalmente em crianças sendo caracterizada por erupçőes palmoplantares vesiculares e estomatite. Echovirus 4 (EV-4) é comumente associado a meningite asséptica. A DMPB EV-4 általi társulását korábban nem írták le. Egy 14 hónapos, lázzal, torokváladékkal és kiütésekkel a tenyéren és a lábfejen jelentkező 14 hónapos gyermektől származó két mintát küldtek az Instituto Adolfo Lutz Enterális Vírusok Laboratóriumába. A mintákat három különböző sejtvonalba oltották be; azokat, amelyek citopátiás hatást (CPE) mutattak, indirekt immunfluoreszcens vizsgálatnak (IFI) és “egylépéses” RT-PCR-nek vetették alá. A PCR-termékkel végzett agarózgél-elektroforézis az Enterovírus csoportra jellemző 437 pb-os terméket mutatott. Az EV-4 szerotípust IFI-vel azonosították. Bár a DMPB elsősorban az Enterovirus 71 (HEV-71) és a Coxsackievirus A16 (CV-A16) vírusfertőzés, eredményeink hangsúlyozzák az EV-4-et mint a DMPB kórokozóját célzó epidemiológiai és laboratóriumi vizsgálatok szükségességét.

BEVEZETÉS

A kéz-, láb- és szájbetegség (HFMD) a csecsemők és 10 év alatti gyermekek gyakori betegsége, amelyet láz, sebek a szájban és hólyagos kiütések jellemeznek. A HFMD enyhe lázzal, rossz étvággyal, rossz közérzettel és gyakran torokfájással kezdődik. Egy-két nappal később láz és a szájban sebek kialakulása figyelhető meg. Általában kis vörös foltok jelennek meg hólyagokkal, amelyek fekélyekké válnak. Ezek általában a nyelven, az ínyen és az arcon belül helyezkednek el. A bőrkiütés 1-2 nap alatt alakul ki, lapos vagy domború piros foltokkal, néhol hólyagokkal. A kiütés nem viszket, és általában a tenyéren és a talpon található. A fenéken is megjelenik. Bár néhány HFMD-ben szenvedő személynél csak kiütések vagy szájfekélyek is előfordulhatnak4.

A fertőzés emberről emberre az orr- és torokváladékkal való közvetlen érintkezéssel vagy széklet útján, szájon át terjed. A HFMD nem terjed háziállatokra vagy más állatokra vagy azokról. A HFMD egyedi esetei világszerte előfordulnak, gyakrabban nyáron és kora ősszel4. Az anyáról a magzatra történő vertikális terjedés is előfordul, de az esetek hosszú távú szövődmények nélkül lezajlanak, az első trimeszterben történő fertőzés spontán vetéléshez vagy méhen belüli növekedési elmaradáshoz vezethet. Egyéb szövődményekről is beszámoltak, többek között szívizomgyulladásról, meningoencephalitisről, tüdőödémáról és akár halálról is16.

Az első HFMD-ről szóló jelentést ROBINSON & RHODES készítette 1958-ban12. Ők egy lázzal és szájüregi elváltozásokkal járó exantémáról számoltak be, amelyet 1957 júniusában és júliusában több mint 60 személynél észleltek a kanadai Torontóban. A 27 vizsgált székletminta kétharmadából izolálták a Coxsackievirus A16 (CV-A16) vírust. A Coxsackievirus következő bejelentett járványa az angliai Birminghamben történt 1960 nyarán, és ALSOP és munkatársai2 írták le, akik a kezeken és lábakon hólyagos elváltozásokat észleltek oropharyngeális elváltozásokkal, és a kitörést kéz-, láb- és szájbetegségnek nevezték el16.

AHFMD-t a pikornavírusok családjába tartozó (egyszálú RNS, nem burkolt) enterovírusok okozzák, és leggyakrabban a CV-A16 vagy az Enterovirus 71 (HEV-71) okozta. A CV-A4-CV-A7, CV-A9, CV-A10, CV-B1-CV-B3 és CV-B5 vírusokkal összefüggő szórványos esetekről is beszámoltak. A fertőzések általában sporadikusak, de rendszeresen előfordulnak járványok. A vírusfertőzés kezdetben a szájnyálkahártyát és a bélnyálkahártyát érinti, majd 24 órán belül átterjed a regionális nyirokcsomókra. A vírusfertőzés gyorsan követi, és a vírus átterjed a szájnyálkahártyára és a bőrre. Körülbelül a fertőzést követő 7. napon a szérum ellenanyagszintje emelkedni kezdhet 6,8.

PATIENSEK ÉS MÓDSZEREK

Minták: 2003 júliusában São Paulo város egyik napközi otthonában HFMD-járvány tört ki, és egy 14 hónapos fiú gyermek két székletmintáját küldték el az Adolfo Lutz Intézet Enterális Vírusok Laboratóriumába. A gyermek lázas volt, sebek voltak a szájban, rossz közérzet, étvágytalanság és kiütések a tenyéren és a talpon. Ugyanazon központ másik nyolc, 10 hónapos és hároméves kor közötti gyermeke hasonló tüneteket mutatott. A HFMD-t más egészségügyi központokban diagnosztizálták (személyes közlés). Lehetetlen volt párosított szérummintákat gyűjteni ahhoz, hogy a szerológiai vizsgálatokat az antitest-titráláshoz folytatni lehessen.

Vírusok izolálása és azonosítása: Az öleléstől számított hat napon belül gyűjtött mintákat 10 000 x g/60 perces centrifugálással, 4 ºC-on tisztítottuk; antibiotikumokat (streptomicint és penicillint ) adtunk hozzá, és a felülúszót -70 ºC-on tároltuk a beoltásig (0,1 és 0,2 ml/cső) három különböző sejtvonalon: RD (humán rhabdomyoszarkóma), HEp 2 (humán gégerák epidermális karcinóma) és Vero (zöld majomvese), amelyek minimálisan esszenciális táptalajt (Eagle’s L15, Eagle’s + AANE + piruvát, illetve 199 táptalajt) tartalmaztak. Ezt követően a csöveket 35-37 ºC-on tartottuk. A tenyészeteket naponta megfigyeltük inverz mikroszkóppal, hogy láthatóvá tegyük a citopátiás hatást (CPE). A beoltott anyagot egymás után addig passzíroztuk, amíg a HEV-fertőzésre jellemző CPE nem jelent meg vagy nem jelent meg7.

Közvetett immunfluoreszcencia-mérés – IFA: Amikor a sejtkultúra legalább 75%-ban CPE-t mutatott, lekapartuk a csőből, és a sejtszuszpenziót üveglemezre fújtuk, amelyet levegőn szárítottunk és acetonnal fixáltunk. Ezután közvetett immunfluoreszcens vizsgálatnak (IFA) vetettük alá, a kereskedelemben kapható (Chemicon International Inc., Temecula, CA/USA) specifikus monoklonális antitestek felhasználásával a nemzetség, a csoport és a HEV szerotípusok ellen. A tárgylemezek mélyedéseit epifluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk3.

RT-PCR: A vírus RNS-t Trizol® LS (Invitrogen, kat. 1296-010) és kloroform segítségével extraháltuk az izolált vírusból a gyártó utasítása szerint. A 12 000 xg-nél végzett centrifugálást követően a vizes fázist elválasztottuk, és a kicsapást izopropil-alkohollal végeztük. Az RNS-pelletet 75%-os etanollal mostuk. Az eljárás végén az RNS-t röviden megszárítottuk és Milli-Q vízzel reszuszpendáltuk; RNS-szint adtunk hozzá, és az RNS-t -70 ºC-on tároltuk. A cDNS-t a kivont RNS és a keverék felhasználásával szintetizáltuk: 50 mM MgCl2; 10x PCR-puffer; 1,25 nM dNTP; 20 µM/µL AS1/S1 primer; 2 µL Super Script II RNAse Reverse Transcriptase; 2,5 U/µL TaqQ DNS-polimeráz; 40 U/µL RNAsin és Milli-Q víz. Az amplifikációs reakciókat Gene Amp PCR System 9600 Perkin Elmer termocyclerben végeztük a következő programozással: (42 ºC/1 óra) + (95 ºC/5 perc) + 25 ciklus (94 ºC/1 perc + 50 ºC/2 perc + 72 ºC/1 perc) + (72 ºC/7 perc). A PCR-termékeket 1,5%-os agarózgélen elválasztottuk, etídium-bromiddal megfestettük és UV-fényben vizualizáltuk. Az 5′-nem-transzlált régióra irányított primerek 437bp13 méretű terméket amplifikáltak.

Eredmények

HEV-re utaló CPE: kerekdededés, zsugorodás, nukleáris pyknózis, törékenység és sejtdegeneráció volt érzékeny RD és Vero sejtekben. A pozitív tenyészetek jelentési ideje körülbelül 4-7 nap volt.

Epifluoreszcens mikroszkóp alatt, 400x-nál fényes almazöld fluoreszcencia volt megfigyelhető a sejtek sejtmagjában és/vagy citoplazmájában, ami az echovírus 4 szerotípusra adott pozitív reakciót jelezte. Az IFA negatív volt a többi monoklonális antitestre.

RT-PCR-t alkalmaztak a HEV genus megerősítésére. Az agarózgél-elektroforézis 437 bp hosszúságú terméket mutatott ki, amely azonosította a HEV-t (1. ábra).

Megbeszélés

A jelen vizsgálatban azonosított etiológiai kórokozó a HFMD-vel korábban összefüggésbe hozottaktól eltérő HEV. Ezt a szindrómát általában a CV-A16-tal és a HEV-71-gyel hozták összefüggésbe, míg a HFMD-vel összefüggésbe hozott EV-4-ről nem találtunk epidemiológiai adatokat az irodalomban.

Mindeközben a Malajziában (1997-ben) kitört HFMD-járványt az EV-1, CV-A9 és HEV-711 vírusokkal hozták összefüggésbe. A HEV-71 által okozott HFMD-hez halálos kimenetelű agyvelőgyulladásos eseteket társítottak a malajziai (1997) és tajvani (1998)17 járványok során. Az EV-7-et 2000 második felében a CV-A16 és az EV-7 mellett a HFMD etiológiai kórokozójaként találták meg5. Brazíliában MOREIRA és munkatársai (1995) a coxsackievirus B3-mal (CV-B3) összefüggésbe hozott járványos exantémás megbetegedésről számoltak be10. Brazíliában nincs jelentés az EV-4 és a HFMD kapcsolatáról, talán a klinikai gyanú hiánya miatt.

Az EV-4 általában aszeptikus agyhártyagyulladással, agyvelőgyulladással, bénulással, Güillan-Barré-szindrómával, exanthemával és légzőszervi betegségekkel hozható összefüggésbe, és világszerte megtalálható, főként aszeptikus agyhártyagyulladás-járványok okozójaként: Kubában 1972 és 1999 között; a dél-afrikai Fokvárosban 1981 és 1989 között; 1997 áprilisában Izrael és a Palesztin Hatóság régióiban; Spanyolországban 1988 és 2003 között; 1982 őszén Lengyelországban, valamint 2002-ben Indiában, Vellore-ban és környékén8,9,11,14,15,18 .

Az enterovírus-fertőzések általában tünetmentesek vagy enyhe betegséggel járnak. Ezért ajánlatos szérummintát gyűjteni, hogy mikroneutralizációs technikával folytathassuk az antitest-titrálást, ami egy újabb paraméter lenne annak megerősítésére, hogy az izolált vírus a felelős a betegségért. A székletizolációhoz kapcsolódóan a szérumtitráció négyszeresére való emelkedése (szerokonverzió) megerősíti az akut fertőzést. Sajnos ebben a vizsgálatban nem volt lehetőség szérumminták beszerzésére.

Ennek ellenére a többi nyolc gyermek mindegyikét az egészségügyi központok a klinikai tünetek alapján HFMD-ként diagnosztizálták.

Noha ez az eredmény nem lehet elégséges annak megállapításához, hogy az EV-4 okozta a betegséget, ésszerűnek tűnt a következtetés, hogy a jelek és a nyilvánvaló klinikai megnyilvánulások megerősítik azt a hipotézist, hogy a vírus nem átmenő vírus.

Fontos kiemelni, hogy a HFMD fő okozójaként ismert CV-A16 és HEV-71 általában CPE-t produkál RD, HEp2 és Vero sejtkultúrákban; ebben a vizsgálatban azonban nem azonosították őket.

Munkánk az EV-4-et a HFMD kórokozójaként mutatja be, és felveti annak lehetőségét, hogy más HEV-szerotípusok, esetleg összefüggésbe hozhatók a HFMD-esetekkel. Ez az esetismertetés hangsúlyozza az e szerotípusra vonatkozó járványtani és laboratóriumi vizsgálatok fokozásának szükségességét, és Brazíliában fokozni kell a HFMD-ben szerepet játszó más HEV-szerotípusok felügyeletét.

HÁTTÉRI KÖNYVEK

Kifejezetten hálásak vagyunk Dr. Luís Florêncio Salles Gomesnek a dolgozathoz fűzött javaslataiért és kritikáiért.

1. ABUBAKAR, S.; CHEE, H.Y.; SHAFEE, N.; CHUA, K.B. & LAM, S.K. – Enterovírusok molekuláris kimutatása egy 1997-ben Malajziában kitört kéz-, láb- és szájbetegségből. Scand. J. infect. Dis., 31: 331-335, 1999.

2. ALSOP, J.; FLEWETT, T.H. & FOSTER, J.R. – “Kéz-láb- és szájbetegség” Birminghamben 1959-ben. Brit. med. J., 5214: 1708-1711, 1960.

3. BASTIS, D.; SIMONET, S.; PATTERSON, M.A. & NEILL, S. – Enterovírusok azonosítása indirekt immunfluoreszcenciával monoklonális antitestek felhasználásával. Clin. diagn. Virol., 3: 38-93, 1995.

4. CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION – Respiratory and Enteric Viruses Branch, 2004. (elérhető: http://www.cdc.gov/ncidod/dvrd/revb/Enterovirus/hfhf.htm). Hozzáférés: 2005. május.

5. CHUA, B.H.; McMINN, P.C.; LAM, S.K. & CHUA, K.B. – Az echovírus 7 UMMC törzs és a prototípus (Wallace) törzs teljes nukleotidszekvenciáinak összehasonlítása jelentős időbeli genetikai driftet mutat. J. gen. Virol., 82: 2629-2639, 2001.

6. GRAHAM, B. – Kéz-, száj- és körömfájás. EMedicine Journal, 2002. (elérhető: http://www.emedicine.com/derm/topic175htm). Hozzáférés: 2005. május.

7. GRANDIEN, M.; FORSGREN, M. & EHRNST, A. – Enterovírusok és reovírusok in: LENNETTE, E.H. & SCHMIDT, N.J., szerk. Vírusos és rickettsiális betegségek diagnosztikai eljárásai. 6. szerk. Washington, American Public Health Association, 1989. p. 513-578.

8. HANDSHER, R.; SHULMAN, L.M.; ABRAMOVITZ, B. et al. – A 4. echovírus új változata, amely az aszeptikus agyhártyagyulladás nagyszámú kitöréséhez társul. J. clin. Virol., 13: 29-36, 1999.

9. McINTYRE J.P. & KEEN, G.A. – A vírusos agyhártyagyulladás laboratóriumi felügyelete az agy-gerincvelői folyadék vizsgálatával Fokvárosban 1981-9. Epidem. Infect., 111: 357-371,1993.

10. MOREIRA, R.C.; CASTRIGNANO, S.B.; CARMONA, R.C. et al. – Coxsackievirus B3 fertőzéssel összefüggő exantematikus betegségjárvány egy napközi otthonban. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 37: 235-238, 1995.

11. PIERZCHALA, K.; GRUDZINSKA, B.; BARA, M. & KLOSINSKA, E. – A járványos vírusos meningitis késői következményei. Wiad. lek. 42: 55-158, 1989.

12. ROBINSON, C.R.; DOANE, F.W. & RHODES, A.J. – Jelentés egy lázas betegség kitöréséről torokelváltozásokkal és exantémával: Toronto, 1957 nyara; az A csoportú Coxsackie vírus izolálása. Canad. med. Ass. J., 79: 615-621, 1958.

13. ROTBART, H.A. – Az enterovírusok enzimatikus RNS-amplifikációja. J. clin. Microbiol., 28: 438-442,1990.

14. SARMIENTO, L.; MAS, P.; GOYENECHEA, A. et al. – Az echovírus 16-os meningitis első járványa Kubában. Emerg. infect. Dis., 7: 887-889, 2001.

15. SATHISH, N.; SCOTT, J.X.; SHAJI, R.V. et al. – Echovírusos agyhártyagyulladás kitörése gyermekeknél. Indian Pediat., 41: 384-388, 2004.

16. SCOTT, L.A. & STONE, M.S. – Vírusos exantémák. Derm. Online J., 9: 4, 2003.

17. SHIMIZU, H.; UTAMA, A.; YOSHII, K. et al. – Enterovirus 71 a kéz-, láb- és szájbetegség járványok halálos és nem halálos eseteiből Malajziában, Japánban és Tajvanon 1997-1998-ban. Jap. J. infect. Dis., 52: 12-15, 1999.

18. TRALLERO, G. & AVELLÓN, A. – Importancia del diagnostico de los Echovirus desde el punto de vista epidemiológico. Circulación de Echovirus 11 en los últimos años en España – Control Calidad SEIMC, 2004. (elérhető: http://seimc.org/control/revi_viro/echo11.htm). Hozzáférés: 2005. május,

.